1. Першапачатковае разуменне

На гэтым этапе нам трэба зразумець некаторыя паняцці і тэрміналогію, каб пазбегнуць памылак перад пажылымі людзьмі, напрыклад:

Пытанне: У чым розніца паміж RT-PCR, qPCR, ПЦР у рэальным часе і RT-PCR у рэальным часе?

Адказ: RT-PCR - гэта ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй(ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй, RT-PCR), якая з'яўляецца шырока выкарыстоўваным варыянтам палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЦР).У RT-PCR ланцуг РНК адваротна транскрыбуецца ў камплементарную ДНК, якая затым выкарыстоўваецца ў якасці шаблону для ампліфікацыі ДНК з дапамогай ПЦР.
ПЦР у рэальным часе і кПЦР(Quantitative Rea-ltime-PCR) - гэта адно і тое ж, абодва з'яўляюцца колькаснымі ПЦР у рэальным часе, што азначае, што кожны цыкл ПЦР мае запісы даных у рэальным часе, так што колькасць пачатковых шаблонаў можна рэгуляваць дакладным аналізам.

Нягледзячы на ​​тое, што і ПЦР у рэальным часе (флуоресцентная колькасная ПЦР у рэальным часе), і ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй (ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй), здаецца, скарочана RT-PCR, міжнародная канвенцыя такая: RT-PCR канкрэтна адносіцца да зваротнай транскрыпцыіПЦР, ПЦР у рэальным часе, як правіла, скарочана як ПЦР (колькасная ПЦР у рэальным часе).

І RT-PCR у рэальным часе (RT-qPCR), гэта ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй у спалучэнні з флуоресцентной колькаснай тэхналогіяй: спачатку атрымаць кДНК (RT) з зваротнай транскрыпцыі РНК, а затым выкарыстоўваць ПЦР у рэальным часе для колькаснага аналізу (кПЦР).Большасць лабараторый праводзяць RT-qPCR, гэта значыць даследаванне паніжальнай рэгуляцыі экспрэсіі РНК, так што qPCR, пра які ўсе гавораць у лабараторыі, насамрэч адносіцца да RT-qPCR, але не забывайце, што існуе яшчэ шмат тэстаў ДНК у клінічных прымяненнях.Колькасны аналіз, напрыклад, выяўленне віруса гепатыту B HBV.

Пытанне: пасля прачытання вялікай колькасці флуоресцентной колькаснай ПЦР, чаму ампліфікаваны фрагмент трэба кантраляваць у дыяпазоне 80-300 п.н.?

Адказ: Даўжыня кожнай геннай паслядоўнасці розная, некаторыя складаюць некалькі кб, некаторыя - сотні н.п., але пры распрацоўцы праймераў нам трэба толькі патрабаваць, каб даўжыня прадукту была 80-300 н.п. Занадта кароткія або занадта доўгія не падыходзяць для флуоресцентного колькаснага выяўлення ПЦР.Фрагмент прадукту занадта кароткі, каб яго можна было адрозніць ад грунтоўкі-дымера.Даўжыня праймера-дымера складае каля 30-40 п.н., і цяжка адрозніць, ці з'яўляецца гэта праймер-дымер або прадукт, калі ён менш за 80 п.н.Калі фрагмент прадукту занадта доўгі, перавышаючы 300 п.о., гэта лёгка прывядзе да нізкай эфектыўнасці ампліфікацыі і не можа эфектыўна вызначыць колькасць гена.

Напрыклад, калі вы падлічваеце, колькі чалавек у класе, вам трэба падлічыць толькі тое, колькі ёсць вуснаў.Тое ж самае, калі вы выяўляеце гены, вам трэба выявіць толькі пэўную паслядоўнасць гена, каб прадставіць усю паслядоўнасць.Калі людзей лічыць, трэба лічыць і раты, і насы, і вушы, і акуляры, а памыліцца лёгка.

Каб пашырыць, у біялагічных даследаваннях існуе мноства даследаванняў ад кропкі да вобласці, таму што паслядоўнасць генаў любога віду вельмі доўгая, непатрэбна і немагчыма вымераць усе фрагменты, напрыклад, бактэрыяльнае секвенирование 16S, якое заключаецца ў правядзенні кансерватыўнай паслядоўнасці бактэрый. Аналізы для высновы аб колькасці пэўнай папуляцыі бактэрый.

Пытанне: Якая аптымальная даўжыня для распрацоўкі праймера кПЦР?

Адказ: Наогул кажучы, даўжыня праймера складае каля 20-24 bp, што лепш.Вядома, мы павінны звярнуць увагу на значэнне TM грунтоўкі пры распрацоўцы грунтоўкі, таму што гэта звязана з аптымальнай тэмпературай адпалу.Пасля шматлікіх эксперыментаў было даказана, што 60°C з'яўляецца лепшым значэннем TM.Калі тэмпература адпалу занадта нізкая, гэта лёгка прывядзе да неспецыфічнага ўзмацнення.Калі тэмпература адпалу занадта высокая, эфектыўнасць узмацнення будзе адносна нізкай, пік крывой узмацнення пачнецца пазней, а значэнне CT будзе затрымлівацца.

Пытанне: Чым метад афарбоўвання адрозніваецца ад метаду зонда?

Адказ: метад фарбаванняНекаторыя флуарэсцэнтныя фарбавальнікі, такія як SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO і інш., самі па сабе не выпраменьваюць святло, але будуць выпраменьваць флуарэсцэнцыю пасля звязвання з малой баразёнкай двухланцуговай ДНК.Такім чынам, у пачатку рэакцыі ПЦР апарат не можа выявіць флуоресцентный сігнал.Калі рэакцыя дасягае стадыі адпалу-падаўжэння, двайны ланцуг адкрываецца, і пад дзеяннем ДНК-палімеразы сінтэзуецца новы ланцуг, і флуоресцентная малекула звязваецца з малой баразёнкай дцДНК.Па меры павелічэння колькасці цыклаў ПЦР усё больш і больш фарбавальнікаў спалучаецца з двухцепочечной ДНК, і флуарэсцэнтны сігнал таксама пастаянна ўзмацняецца.Метад фарбавальніка ў асноўным выкарыстоўваецца ў навуковых даследаваннях.
PS: Будзьце асцярожныя пры правядзенні эксперыменту, фарбавальнік павінен спалучацца з ДНК чалавека, будзьце асцярожныя, каб ператварыць яго ў флуоресцентного чалавека.

Метад фарбавання (злева) Метад зонда (справа)
PS: Будзьце асцярожныя пры правядзенні эксперыменту, фарбавальнік павінен спалучацца з ДНК чалавека, будзьце асцярожныя, каб ператварыць яго ў флуоресцентного чалавека.

SYBR Green Ⅰ звязваецца з малой баразёнкай ДНК

Метад зондаЗонд Taqman - найбольш часта выкарыстоўваны зонд для гідролізу.На 5'-канцы зонда ёсць флуоресцентная група, звычайна FAM, а сам зонд з'яўляецца паслядоўнасцю, камплементарнай гену-мішэні.На 3'-канцы ёсць флуоресцентная група тушэння.У адпаведнасці з прынцыпам пераносу энергіі флуарэсцэнтнага рэзанансу (Förster resonance energy transfer, FRET), калі рэпарцёрная флуоресцентная група (донарная флуоресцентная малекула) і тушаючая флуоресцентная група (акцэптарная флуоресцентная малекула) узбуджаюцца. Калі спектры перакрываюцца і адлегласць вельмі блізкая (7-10 нм), узбуджэнне донарнай малекулы можа выклікаць флуарэсцэнцыю малекулы-акцэптара, пры гэтым аўтафлюарэсцэнцыя аслаблена.Такім чынам, у пачатку рэакцыі ПЦР, калі зонд вольны і непашкоджаны ў сістэме, рэпарцёрная флуоресцентная група не будзе выпраменьваць флуарэсцэнцыю.Пры адпале праймер і зонд звязваюцца з шаблонам.На стадыі падаўжэння палімераза бесперапынна сінтэзуе новыя ланцугі.ДНК-палімераза валодае 5'-3' экзонуклеазной актыўнасцю.Дасягнуўшы зонда, ДНК-палімераза гідролізуе зонд з шаблону, аддзяліць рэпарцёрную флуоресцентную групу ад тушыцельнай флуоресцентной групы і вызваліць флуоресцентный сігнал.Паколькі паміж зондам і шаблонам існуе адназначная сувязь, метад зонда пераўзыходзіць метад фарбавальніка з пункту гледжання дакладнасці і адчувальнасці тэсту.У дыягностыцы ў асноўным выкарыстоўваецца зондавы метад.

Пытанне: што такое абсалютная колькасная ацэнка?Што такое адносная колькасная ацэнка?

Адказ: Абсалютная колькасная ацэнка адносіцца да разліку колькасці пачатковай копіі ўзору, які трэба праверыць з дапамогай КПЦР, напрыклад, колькасці вірусаў ВГВ у 1 мл крыві.Вынік, атрыманы адноснай колькаснай ацэнкай, - гэта змяненне колькасці гена-мішэні ў пэўным узоры адносна іншага эталоннага ўзору, і экспрэсія гена рэгулюецца ўверх або ўніз.

Пытанне: Ці паўплывае колькасць экстракцыі РНК, эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі і эфектыўнасць ампліфікацыі на вынікі эксперыментаў?
Пытанне: ці паўплываюць на вынікі эксперыменту захоўванне ўзораў, рэагенты для экстракцыі, рэагенты для зваротнай транскрыпцыі і расходныя матэрыялы, якія прапускаюць святло?
Пытанне: якім метадам можна выправіць эксперыментальныя дадзеныя?

Што тычыцца гэтых праблем, мы падрабязна апішам іх у пашыраных і прасунутых раздзелах ніжэй.
2. Паглыбленыя веды

Што датычыцца флуоресцентной колькаснай ПЦР у рэжыме рэальнага часу, мы павінны прызнаць, што кожны год публікуюцца тысячы навуковых прац, сярод якіх тэхналогія флуоресцентной колькаснай ПЦР не малая.

Калі няма агульнага стандарту для вымярэння эксперыменту флуоресцентной колькаснай ПЦР, вынікі могуць моцна адрознівацца.Для аднаго і таго ж гена таго ж віду з аднолькавым метадам апрацоўкі вынікі выяўлення таксама будуць моцна адрознівацца, і тым, хто спазніўся, будзе цяжка паўтарыць тыя ж вынікі.Вы Ніхто не ведае, што правільна, а што не.

Ці азначае гэта, што флуоресцентная колькасная ПЦР з'яўляецца падманнай тэхналогіяй або ненадзейнай?Не, гэта таму, што люмінесцэнтная колькасная ПЦР больш адчувальная і дакладная, і няправільная аперацыя прывядзе да зусім супрацьлеглых вынікаў.Невялікая страта - за тысячу міль.Аўтар артыкула можа быць неаднаразова закатаваны рэцэнзентамі.У той жа час, рэцэнзентам часопіса таксама цяжка выбраць з розных эксперыментальных вынікаў.

Увогуле, гэта паказвае на адсутнасць кансенсусу ў эксперыментах ПЦР у рэальным часе.З гэтай мэтай старэйшыя навукоўцы галіны пачалі распрацоўваць стандарты,патрабуючы ад удзельнікаў даць некаторыя неабходныя дэталі эксперыменту і апрацоўкі дадзеных (уключаючы неабходныя дадзеныя) у артыкуле, каб адпавядаць гэтым стандартам.

Рэцэнзенты могуць судзіць аб якасці эксперыменту, прачытаўшы гэтыя дэталі;будучыя чытачы таксама могуць выкарыстоўваць гэта, каб паўтарыць эксперымент або палепшыць эксперымент.Тады эксперыментальныя вынікі, атрыманыя такім чынам, насычаны інфармацыяй, высокай якасці і прыдатныя для выкарыстання.

MIBBI (Мінімальная інфармацыя для біялагічных і біямедыцынскіх даследаванняў -http://www.mibbi.org) узнікла.MIBBI - гэта праект, які забяспечвае стандарты для эксперыментаў.Выдаецца ў натуры.Гэты праект накіраваны на розныя біялагічныя эксперыменты, у тым ліку клетачную біялогію, мікрачыпы, кПЦР, якія мы зараз абмяркуем, і г.д., і прадугледжвае кожны тып эксперыменту пры падачы рукапісаў.Гэтая інфармацыя павінна быць прадастаўлена заўсёды.

У праекце MIBBI ёсць два артыкулы, звязаныя з флуоресцентной колькаснай ПЦР, а менавіта:
·RDML (мова разметкі дадзеных ПЦР у рэальным часе) – структураваная мова і кіраўніцтва па справаздачнасці для колькасных дадзеных ПЦР у рэальным часе;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – мінімум інфармацыі для публікацыі артыкулаў пра колькасныя ПЦР-эксперыменты ў рэальным часе.
Спачатку пагаворым аб RDML, спецыфікацыі тэрміналогіі.

Калі няма стандартнага вызначэння для ўсяго, немагчыма працягваць абмеркаванне, таму тлумачэнне тэрмінаў так важна на экзамене.
Тэрміналогія, якая выкарыстоўваецца ў эксперыменце флуоресцентной колькаснай ПЦР, уключае наступны змест.QIAGEN зрабіў лепшае рэзюмэ для нас.Наступныя ўсе сухіятавары .

Крывая ўзмацнення
Крывая ампліфікацыі адносіцца да крывой, зробленай у працэсе ПЦР, з нумарам цыклу па восі абсцыс і інтэнсіўнасцю флуарэсцэнцыі ў рэальным часе падчас рэакцыі па восі ардынат.

Выдатная крывая ўзмацнення павінна мець наступныя характарыстыкі: базавая лінія роўная або злёгку паніжаная, і няма відавочнай тэндэнцыі да росту;кропка перагіну крывой выразная, а нахіл экспаненты прапарцыянальны эфектыўнасці ўзмацнення.Чым больш нахіл, тым вышэй эфектыўнасць узмацнення;агульная крывая ўзмацнення Паралелізм добры, што паказвае на тое, што эфектыўнасць узмацнення кожнай трубкі аднолькавая;відавочная экспанентная фаза крывой ампліфікацыі узораў з нізкай канцэнтрацыяй.

Базавая лінія (базавая лінія)
Базавы ўзровень - гэта ўзровень шуму ранняга цыклу, як правіла, вымяраецца паміж 3-м і 15-м цыклам, таму што павышэнне значэння флуарэсцэнцыі, выкліканае прадуктам ампліфікацыі, не можа быць выяўлена ў гэты перыяд.Колькасць цыклаў, якія выкарыстоўваюцца для разліку зыходнага ўзроўню, можа вар'іравацца і, магчыма, спатрэбіцца паменшыць, калі выкарыстоўваюцца вялікія сумы шаблону або калі ўзровень экспрэсіі мэтавага гена высокі.

Устанаўленне базавай лініі патрабуе прагляду дадзеных флуарэсцэнцыі з крывой узмацнення лінейнасці.Базавая лінія ўсталёўваецца такім чынам, каб рост крывой ампліфікацыі пачынаўся з нумара цыклу, большага за верхні нумар базавага цыклу.Базавыя паказчыкі неабходна ўсталёўваць індывідуальна для кожнай мэтавай паслядоўнасці.Сярэднія значэнні флуарэсцэнцыі, выяўленыя ў ранніх цыклах, неабходна адняць ад значэнняў флуарэсцэнцыі, атрыманых у амплифицированных прадуктах.Апошнія версіі розных праграм ПЦР у рэальным часе дазваляюць аўтаматычна аптымізаваць базавыя налады для асобных узораў.

На працягу першых некалькіх цыклаў рэакцыі ампліфікацыі ПЦР сігнал флуарэсцэнцыі істотна не змяняецца.Набліжэнне да прамой лініі называецца базавай лініяй, але калі мы ўважліва паглядзім на некалькі першых цыклаў, мы ўбачым, што ўнутры базавай лініі адбываецца тое, што адбываецца на малюнку ніжэй.

Фон Фон ставіцца да
значэнне неспецыфічнай флуарэсцэнцыі ў рэакцыі.Напрыклад: неэфектыўнае гашэнне флуарэсцэнцыі;або вялікая колькасць двухцепочечных шаблонаў ДНК з-за выкарыстання SYBR Green.Фонавыя кампаненты сігналу выдаляюцца матэматычна з дапамогай праграмнага алгарытму ПЦР у рэальным часе.

Сігнал рэпарцёра
Сігнал рэпарцёра адносіцца да флуоресцентного сігналу, які ствараецца SYBR Green або флуоресцентно пазначаных спецыфічнымі для паслядоўнасці зондамі падчас ПЦР у рэальным часе.

Нармалізаваны сігнал рэпарцёра (RN)
RN адносіцца да інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі рэпарцёрнага фарбавальніка, падзеленай на інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі пасіўнага эталоннага фарбавальніка, вымеранай у кожным цыкле.

Пасіўны эталонны фарбавальнік
У некаторых ПЦР у рэальным часе,флуоресцентный фарбавальнік ROX выкарыстоўваецца ў якасці ўнутранага эталона для нармалізацыі флуоресцентного сігналу.Ён карэктуе варыяцыі, выкліканыя недакладным піпетаваннем, становішчам лункі і ваганнямі флуарэсцэнцыі па кожнай лунцы.

Парог флуарэсцэнцыі (парог)
быў скарэкціраваны вышэй за фонавае значэнне і значна ніжэй за значэнне плато крывой ампліфікацыі.Ён павінен ляжаць у лінейнай вобласці крывой ампліфікацыі, якая прадстаўляе лагалінейны дыяпазон выяўлення ПЦР.Парогавыя значэнні павінны быць устаноўлены ў праглядзе крывой лагарыфікацыйнай ампліфікацыі, каб можна было лёгка ідэнтыфікаваць лінейную логарымальную фазу ПЦР.Калі ў ПЦР у рэальным часе ёсць некалькі генаў-мішэняў, парог павінен быць усталяваны для кожнай мішэні.Як правіла, сігнал флуарэсцэнцыі першых 15 цыклаў рэакцыі ПЦР выкарыстоўваецца ў якасці фонавага сігналу флуарэсцэнцыі, а парог флуарэсцэнцыі ў 10 разоў перавышае стандартнае адхіленне сігналу флуарэсцэнцыі першых 3-15 цыклаў ПЦР, а парог флуарэсцэнцыі ўсталёўваецца ў экспанентнай фазе ампліфікацыі ПЦР.Увогуле, кожны інструмент мае свой парог флуарэсцэнцыі, усталяваны перад выкарыстаннем.

Парог цыклу (CT) або кропка перасячэння (CP)
Цыкл, пры якім крывая ампліфікацыі перасякае парог (г.зн. кропка, пры якой выяўленне флуарэсцэнцыі значна павялічваецца).CT можа быць доляй, і можна вылічыць колькасць стартавага шаблону.Значэнне CT уяўляе сабой колькасць цыклаў, калі флуоресцентный сігнал у кожнай рэакцыйнай прабірцы ПЦР дасягае зададзенага парога.Існуе лінейная залежнасць паміж значэннем CT кожнага шаблона і лагарыфмам першапачатковага нумара копіі шаблона,чым больш першапачатковая колькасць копій, тым меншае значэнне CT, і наадварот.Стандартную крывую можна зрабіць з дапамогай стандарту з вядомым пачатковым нумарам копіі, дзе па восі абсцыс паказваецца значэнне CT, а па восі ардынат - лагарыфм пачатковага нумара копіі.Такім чынам, пакуль атрымана значэнне CT невядомага ўзору, пачатковую колькасць копій узору можна вылічыць па стандартнай крывой.

Значэнне ΔCT
Значэнне ΔCT апісваерозніца паміж мэтавым генам і адпаведным значэннем CT эндагеннага эталоннага гена, напрыклад ген хатняй гаспадаркі, і выкарыстоўваецца для нармалізацыі колькасці выкарыстоўванага шаблону:
⇒ΔCT = CT (ген-мішэнь) – CT (эндагенны эталонны ген)

ΔΔCT Значэнне
Значэнне ΔΔCT апісвае розніцу паміж сярэднім значэннем ΔΔCT цікавага ўзору (напрыклад, стымуляваных клетак) і сярэднім значэннем ΔΔCT эталоннага ўзору (напрыклад, нестымуляваных клетак).Эталонны ўзор таксама называецца калібравальным узорам, і ўсе астатнія ўзоры нармалізуюцца на яго для адноснага колькаснага вызначэння:
⇒ΔΔCT = сярэдняе ΔCT (узор, які цікавіць) – сярэдні ΔCT (эталонны ўзор)

Эндагенныя эталонныя гены (эндагенныя эталонныя гены)
Узроўні экспрэсіі эндагенных эталонных генаў, такіх як гены хатняй гаспадаркі (гены хатняй гаспадаркі), не адрозніваюцца паміж узорамі.Параўнанне значэнняў CT эталоннага гена з генам-мішэнню дазваляе нармалізаваць узровень экспрэсіі гена-мішэні ў адпаведнасці з колькасцю ўведзенай РНК або кДНК (гл. раздзел пра значэнні ΔCT вышэй).

Унутраныя эталонныя гены правільныя длямагчымая дэградацыя РНК або наяўнасць інгібітараў ферментаў ва ўзорах РНК, а таксама варыяцыі ўтрымання РНК, эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі, аднаўлення нуклеінавых кіслот і апрацоўкі ўзораў.Каб выбраць аптымальны эталонны ген (гены), мы змянілі алгарытм, каб дазволіць выбар аптымальнага эталоннага гена ў залежнасці ад эксперыментальных налад.

Унутраны кантроль
Кантрольная паслядоўнасць, якая ўзмацняецца ў той жа рэакцыі, што і паслядоўнасць-мішэнь, і даследуецца з дапамогай іншага зонда (напрыклад, з дапамогай дуплекснай ПЦР).Унутраны кантроль часта выкарыстоўваецца для выключэння няўдалага ўзмацнення, напрыклад, калі мэтавая паслядоўнасць не вызначана.
Узор каліброўкі
Эталонны ўзор (напрыклад, вычышчаная РНК з клетачнай лініі або тканіны), які выкарыстоўваецца ў адносным колькасным вызначэнні для параўнання ўсіх іншых узораў для вызначэння адноснага ўзроўню экспрэсіі гена.Калібравальны ўзор можа быць любым узорам, але звычайна гэта кантроль (напрыклад, неапрацаваны ўзор або ўзор з нулявога часу эксперыменту).

Станоўчы кантроль
выкарыстоўваць рэакцыі кіравання свядомыя колькасці шаблонаў.Станоўчы кантроль часта выкарыстоўваецца для праверкі таго, што набор праймераў або набор праймер-зонд працуе належным чынам і што рэакцыя настроена правільна.

Без кантролю шаблонаў (NTC)
Кантрольная рэакцыя, якая змяшчае ўсе неабходныя кампаненты рэакцыі ампліфікацыі, акрамя шаблону, які звычайна замяняецца вадой.Выкарыстанне NTC можа знайсці забруджванне, выкліканае забруджваннем рэагентам або іншароднай ДНК, забяспечваючы такім чынам сапраўднасць і надзейнасць дадзеных выяўлення.Узмацненне кантролю NTC паказвае на заражэнне.

Няма кантролю RT (NRT)
Працэс экстракцыі РНК можа ўтрымліваць рэшткавую геномную ДНК, якая надзвычай шкодная і з'яўляецца вінаватым у зніжэнні якасці даных і з'яўляецца натуральным ворагам кПЦР, таму пры планаванні эксперыментаў ён павінен быць распрацаваны толькі для ўзмацнення выяўлення РНК.Ёсць два спосабы: адзін - распрацаваць праймеры праз інтроны, другі - поўнае выдаленне ДНК, які з іх лепш, пра што мы раскажам пазней.Кантроль NTR - гэта чароўнае люстэрка для выяўлення забруджвання ДНК.Калі ёсць узмацненне, значыць, ёсць забруджванне.

Стандарты
Стандарты - гэта ўзоры з вядомай канцэнтрацыяй або колькасцю копій, якія выкарыстоўваюцца для пабудовы стандартнай крывой.Для забеспячэння стабільнасці стандарту фрагмент гена звычайна клануюць у плазміду і выкарыстоўваюць у якасці стандарту.

Стандартная крывая
звычайна разводзіцца як мінімум у 5 градыентах канцэнтрацыі са стандартным прадуктам у адпаведнасці з каэфіцыентам падваення, і 5 кропак малююцца ў каардынатах значэння CT і колькасці копій, і кропкі злучаюцца ў лінію для стварэння стандартнай крывой.Для кожнай стандартнай крывой неабходна праверыць яе сапраўднасць.Значэнне нахілу знаходзіцца ў межах ад –3,3 да –3,8, і кожная канцэнтрацыя выконваецца ў трох паўторах.Акуляры, якія значна адрозніваюцца ад іншых пунктаў, варта адкінуць.Значэнне КТ узору, які трэба праверыць, уводзіцца ў стандартную крывую, і можна вылічыць узровень экспрэсіі ўзору, які трэба праверыць.

Значэнне CT ўзору, які трэба праверыць, уводзіцца ў стандартную крывую, і можна вылічыць пачатковую колькасць копій узору, які трэба праверыць.

Эфектыўнасць і нахіл
Нахіл стандартнай крывой паказвае эфектыўнасць ПЦР у рэальным часе.
·Нахіл -3,322 паказвае на тое, што эфектыўнасць ПЦР-ампліфікацыі роўная 1, або 100% эфектыўнасці, а колькасць прадукту ПЦР падвойваецца пры кожным цыкле.
· Нахіл менш за –3,322 (напрыклад, –3,8) паказвае на эфектыўнасць ПЦР
· Нахіл, большы за –3,322 (напрыклад, –3,0), паказвае, што эфектыўнасць ПЦР, здаецца, перавышае 100%, што цікава, як адзін цыкл ПЦР можа генераваць больш чым удвая большы прадукт ампліфікацыі?Такая сітуацыя ўзнікае ў нелінейнай фазе рэакцыі ПЦР, гэта значыць адбываецца вялікая колькасць неспецыфічнай ампліфікацыі.

крывая плаўлення
Пасля завяршэння ампліфікацыі qPCR прадукт ПЦР награваецца.Па меры павышэння тэмпературы двухцепочечный прадукт ампліфікацыі паступова плавіцца, што прыводзіць да зніжэння інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі.Пры дасягненні пэўнай тэмпературы (Tm) вялікая колькасць прадуктаў расплавіцца.Флуарэсцэнцыя рэзка падае.Розныя прадукты ПЦР маюць розныя значэнні Tm і розныя тэмпературы плаўлення, так што можна вызначыць спецыфічнасць ПЦР.

Крывая плаўлення (вытворная крывая)
Крывая плаўлення атрымана для фарміравання карты пікаў, якая можа больш інтуітыўна адлюстроўваць сітуацыю з фрагментамі прадукту ПЦР.Паколькі тэмпература плаўлення з'яўляецца значэннем Tm фрагмента ДНК, можна меркаваць аб некаторых параметрах, якія ўплываюць на значэнне Tm фрагмента ДНК, такіх як памер фрагмента, утрыманне GC і г.д.даўжыня амплифицированного прадукту знаходзіцца ў дыяпазоне 80-300 bp, таму тэмпература плаўлення павінна быць паміж 80°C і 90°C.

Інтэрпрэтацыя крывой плаўлення: Калі адзіны асноўны пік з'яўляецца паміж 80°C-90°C, гэта азначае, што флуоресцентная колькасная ПЦР ідэальная;калі асноўны пік з'яўляецца паміж 80°C-90°C, а іншыя пікі з'яўляюцца ніжэй за 80°C, у асноўным лічыцца дымер праймера.Вы можаце паспрабаваць павялічыць тэмпературу адпалу, каб вырашыць гэта;калі асноўны пік з'яўляецца паміж 80°C-90°C, а іншы пік з'яўляецца зноў, калі тэмпература павышаецца, у асноўным лічыцца, што існуе забруджванне ДНК, і ДНК неабходна выдаліць на пачатковым этапе эксперыменту.

Вядома, ёсць яшчэ некаторыя ненармальныя сітуацыі, якія будуць разабраныя ніжэй.
3. Паглыбленыя веды

Каб зрабіць кПЦР, я павінен сказаць MIQE,Мінімум інфармацыідля публікацыіКолькасныПЦР у рэальным часеЭксперыменты — мінімум інфармацыі для публікацыі артыкулаў пра колькасную ПЦР у рэальным часеэксперыменты .Каб спрасціць усім разуменне, мы спросцім асноўны змест.

Вы можаце пашукаць арыгінальны тэкст MIQE ў Інтэрнэце, і самае галоўнае, што ён прадугледжваекантрольны спіс дадзеных, якія неабходна прадаставіць пры публікацыі артыкула .

Рэцэнзенты могуць судзіць аб якасці эксперыменту, прачытаўшы гэтыя дэталі;будучыя чытачы таксама могуць выкарыстоўваць гэта, каб паўтарыць або палепшыць эксперымент.
Варта адзначыць, што ў гэтым спісе важнасць кожнага спісу пазначана літарамі E або D адпаведна.Што гэта значыць?E: важная інфармацыя (неабходна падаць);D: пажаданая інфармацыя (прадстаўце як мага больш).

MIQE (1)—Эксперыментальны дызайн
Многія адмарозкі, якія абараніліся пасля заканчэння аспірантуры, не ўмеюць самастойна распрацоўваць эксперымент, адкрываць сшыткі і рабіць тое, што скажа настаўнік.У выніку эксперыментальны дызайн не быў строгім, і рэдакцыя часопіса заявіла, што хоча зрабіць гэты здымак і гэты здымак, таму яны зрабілі гэта ў ачмурэнні.Вось як робяцца падонкі!

Бліжэй да дому першы прынцып эксперыменту - вызначыцьстрогасць эксперыментальнай логікі.Самая фундаментальная рэч - гэта план эксперыменту, і самае важнае ў плане эксперыменту - гэта тое, як усталяваць мэтавы ўзор, эталонны ўзор (кантроль) і колькасць паўтораў, каб эксперыментальныя дадзеныя маглі быць спасылкамі, супастаўнымі і пераканаўчымі.

Мэтавая пробаадносіцца да ўзору, які патрабуе ад нас выяўлення мэтавага гена пасля пэўнага лячэння.Эталонны ўзор- гэта ўзор без апрацоўкі, які ў біялогіі часта называюць дзікім тыпам.

Эксперыментальныя копіівельмі важныя.Як правіла, колькасць пераканаўчых паўтораў павінна быць больш за тры.Неабходна адрозніваць, што такое біялагічная рэплікацыя, а што такое тэхнічная.

Біялагічныя рэплікі: той самы праверачны эксперымент, праведзены з рознымі матэрыяламі (час, расліны, партыі, рэакцыйныя пласціны).

Біялагічнае дубляванне
У якасці прыкладу возьмем апрацоўку перцу пестыцыдамі.Мы хочам распыліць пестыцыды на тры расліны ABC, тады тры расліны ABC з'яўляюцца трыма біялагічнымі копіямі, і гэта адзін і той жа праверачны эксперымент, які праводзіцца з рознымі матэрыяламі.Але ў якасці эксперыменту, безумоўна, неабходны кантроль, таму мы можам апырскаць адну з галін расліны А, каб сфармаваць эксперыментальную групу расліны А, і не апырскваць іншыя галіны расліны А, каб сфармаваць кантрольную групу.Зрабіце тое ж самае для B і C.

Тэхнічныя копіі (тэхнічныя копіі): Гэта паўторны эксперымент, прызначаны для таго, каб пазбегнуць памылак, выкліканых працай, якая насамрэч з'яўляецца дублікатам адтуліны ў тым самым матэрыяле.Абодва метады лячэння і кантроль павінны мець параметры рэплікацыі (мінімум тры) гена-мішэні і ўнутранага эталоннага гена.

Тэхнічны паўтор
У якасці прыкладу зноў возьмем перац, апрацаваны пестыцыдамі.Для доследнай групы расліны A мы зрабілі тры ПЦР-лункі 1, 2 і 3 для мэтавага гена і ўнутранага эталоннага гена адпаведна, каб атрымаць сярэдняе значэнне пасля выяўлення.Для барацьбы з раслінамі групы А таксама абыходзяцца такім жа чынам.Аналагічным чынам выканайце тую ж апрацоўку раслін B і C.Гэта тэхнічны паўтор.

Варта адзначыць, штотое, што ўваходзіць у статыстыку, - гэта біялагічнае паўтарэнне, а тэхнічнае паўтарэнне - гэта праверыць, ці ёсць у эксперыментальным працэсе якія-небудзь выпадковыя з'явы, каб зрабіць эксперыментальныя вынікі надзейнымі, гэта значыць, каб пазбегнуць памылак, узяўшы іх сярэдняе значэнне, як мы часта гаворым.

Адмоўны кантроль - NTC і NRT
NTC (кантроль без шаблонаў), кантроль без шаблону, выкарыстоўваецца для праверкі забруджанасці эксперыментальнага матэрыялу.Звычайна ў якасці шаблону выкарыстоўваецца вада.Калі ёсць флуоресцентная рэакцыя, гэта сведчыць аб тым, што ў лабараторыі адбылося заражэнне нуклеінавай кіслатой.

Гэтыя забруджванні паходзяць з: нячыстай вады, некваліфікаваных рэагентаў, якія змяшчаюць эндагенную ДНК, забруджвання праймераў, забруджвання лабараторнага абсталявання, аэразольных забруджванняў і г.д., неабходна выкарыстоўваць паглынальнікі РНКазы і інгібітары РНКазы.Цяжэй за ўсё выявіць аэразольнае забруджванне.Уявіце, што ваша лабараторыя падобная на смог з рознымі нуклеінавымі кіслотамі, падвешанымі ў паветры.

НЗТ (без зваротнай транскрыптазы), кантроль без зваротнай транскрыпцыі, - гэта РНК без зваротнай транскрыпцыі ў якасці адмоўнага кантролю, які з'яўляецца кантролем астатку гДНК.

Пры выкананні экспрэсіі генаў колькасць РНК выяўляецца шляхам выяўлення колькасці кДНК пасля зваротнай транскрыпцыі.Калі пры ачыстцы РНК ёсць рэшткі гДНК, гэта прывядзе да памылак у выніках эксперыменту, таму што фактычныя вынікі з'яўляюцца гДНК і кДНК.На сукупным узроўні, а не толькі кДНК, гДНК неабходна цалкам выдаліць падчас экстракцыі РНК.

MIQE (2)—узор інфармацыі
Так званы ўзор інфармацыі азначае, што калі мы публікуем артыкул пра кПЦР, мы павінны дакладна растлумачыць узор інфармацыі, які з'яўляецца неад'емнай часткай артыкула.Аналагічным чынам, калі мы апрацоўваем узоры, мы таксама павінны рэгуляваць нашы ўласныя аперацыі, каб гарантаваць сапраўднасць узораў.

Апісанне ўзору - толькі вынік, і мы павінны звярнуць больш увагі на матэрыялы, узятыя на працягу ўсяго эксперыменту.

Адбор эксперыментальных матэрыялаў
Узоры крыві – выбіраюць свежую кроў, не больш за 4 гадзіны.Узоры клетак - выбірайце свежыя клеткі ў перыяд інтэнсіўнага росту.Тканіна жывёльнага паходжання - выбірайце свежую тканіну, якая актыўна расце.Раслінная тканіна - выбірайце свежую маладую тканіну.

Вы, напэўна, заўважылі, што ў гэтых некалькіх сказах ёсць ключавое слова: свежы .
Для вышэйзгаданых узораў лепшым, эканамічна эфектыўным і стабільным наборам на рынку з'яўляецца набор Foregene, які можа хутка і лёгка здабываць іх ДНК і РНК.

Міні-набор ДНК крыві

Набор для вылучэння агульнай РНК клетак

Набор для вылучэння агульнай РНК жывёл

Набор для вылучэння агульнай РНК раслін

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Набор для выдзялення ДНК раслін

Захоўванне эксперыментальных матэрыялаў
Наогул кажучы, мы не рэкамендуем захоўваць узоры, калі гэта дазваляюць умовы.Тым не менш, ёсць шмат сяброў, якія не могуць праводзіць эксперыменты адразу пасля ўзяцця проб, а некаторым нават трэба несці ў поле ёмістасці з вадкім азотам для ўзяцця проб.

Для такога працавітага сябра я магу толькі сказаць, што вы не разумееце расходных матэрыялаў для рэагентаў.Зараз многія кампаніі, якія займаюцца расходнымі матэрыяламі рэагентаў, вырабляюць рэагенты, у якіх можна захоўваць узоры РНК пры пакаёвай тэмпературы, і вы можаце выкарыстоўваць іх.Звычайны спосаб захоўвання - захоўванне ў вадкім азоте з выкарыстаннем невялікага рэзервуара для вадкага азоту, які лёгка насіць з сабой.Пасля вяртання ўзору ў лабараторыю захоўвайце яго ў халадзільніку пры -80°C.

Для эксперыментаў з удзелам РНК неабходна прытрымлівацца прынцыпу шасці слоў:нізкая тэмпература, без ферментаў,іхуткі .

Паняцце нізкай тэмпературы лёгка зразумець;без ферментаў РНКаза паўсюль у свеце, у якім мы жывем (інакш вы б загінулі ад ВІЧ), таму як пазбегнуць РНКазы пры правядзенні эксперыментаў - вельмі важная канцэпцыя;хутка,У свеце няма кунг-фу, якое нельга зламаць, нельга зламаць толькі хуткасць.

Такім чынам, у пэўным сэнсе, чым карацей час экстракцыі, тым лепш камплект.Чаму робіцьForegeneКамплект робіць акцэнт на хуткасці, таму што яны гэта добра ведаюць.

PS: Некаторыя дзяўчаты робяць эксперыменты вельмі асцярожна, але яны не так добрыя, як слэм-данк пасля некалькіх гадоў працы.Яны адчуваюць, што Бог несправядлівы, скардзяцца на іншых і шукаюць жыцця.На самай справе яна гэтага не разумела.Ён дрэнна абараняў РНК, і гулец у слэм-данк быў спрытным.Калі ён рабіў эксперымент, ён думаў, што скончыць слэм-данк з трыма, пяццю і двума дзяленнямі, але ён зрабіў эксперымент добра.

Нататка: Павольней, больш шанцаў на ўварванне РНКазы.Як прывучыць сябе быць хуткім?Няма магчымасці, проста больш трэніруйцеся.

Для розных эксперыментаў і розных узораў усё роўна неабходна прачытаць больш літаратуры і выбраць прыдатны метад апрацоўкі.Для працэсу збору і захоўвання ўзораў MIQE патрабуе, каб гэта было выразна напісана ў артыкуле, каб рэцэнзенты маглі праверыць надзейнасць дакумента, а таксама было зручна для ашаломленых маладых людзей паўтарыць ваш эксперымент.

Хоць біялагічныя эксперыменты складаныя, яны высокага класа.Калі вы не будзеце асцярожныя, вы можаце перавярнуць свет.Напрыклад, ператварыць ВРВІ ў біяхімічны крызіс або зрабіць гібрыдны рыс, каб выратаваць 1,3 мільярда чалавек.На малюнку ніжэй прадстаўлены хімічны эксперымент. Вы павінны зразумець, наколькі вы ганарыцеся сваім даследаваннем, проста зірнуўшы на яго выгляд, падобны да члена.Забудзься, не чарні яго.

MIQE (3) – экстракцыя нуклеінавых кіслот.
Экстракцыя нуклеінавых кіслот - гэта вялікая падзея, і ўсе эксперыменты па малекулярнай біялогіі пачынаюцца з экстракцыі нуклеінавых кіслот.Перш за ўсё, давайце скапіруем змест MIQE аб экстракцыі нуклеінавых кіслот.

Гледзячы на ​​гэтую форму, нельга застацца на паверхні.Форма - догма.Каб быць лепшым студэнтам, вы павінны спытаць, чаму.Істотны змест гэтай табліцы: Пераследчысціня, цэласнасць, кансістэнцыя і колькасць экстракцыі РНК .

Першая частка стпрацэс або інструмент - гэта этап экстракцыі нуклеінавых кіслот.Калі вы выкарыстоўваеце для экстракцыі аўтаматычны экстрактар ​​нуклеінавых кіслот (прасунуты, калі ласка, звяжыцеся са мной для пакупкі), вам трэба пазначыць назву мадэлі прыбора.

Назва камплекта і

які набор быў выкарыстаны для дэталяў змены, якія спецыяльныя рэагенты былі дададзены або якія спецыяльныя аперацыі былі зроблены, трэба дакладна растлумачыць, каб іншыя маглі лёгка паўтарыць ваш эксперымент.

Некаторыя людзі дадаюць спецыяльныя рэагенты пры здабычы спецыяльных узораў, думаючы, што гэта іх сакрэтная зброя, і не кажуць іншым.Захоўваючы гэта ў сакрэце, яны таксама губляюць магчымасць зрабіць ваш артыкул яркім.Не будзь разумным, ты павінен быць больш сумленным, чым вясковы стары Чжан у навуковых даследаваннях, калі ты хочаш быць разумным, артыкул зробіць цябе дурным.

неабходна запомніць нумар прадукту ў камплекцекалі вы заказваеце камплект і пішаце артыкул.У камплекце звычайна два нумары: Cat—каталожны нумар (нумар прадукту, нумар артыкула), Lot—нумар партыі прадукту (выкарыстоўваецца для ўказання, з якой партыі паходзіць прадукт).

Акрамя таго, нумар CAS часта выкарыстоўваюць пры замове біяхімічных рэагентаў, і я яго разам буду папулярызаваць.Нумар CAS - гэта нумар, які Амерыканскае хімічнае таварыства прысвойвае кожнаму новаму хімічнаму прэпарату.Як правіла, тры лічбы злучаюцца працяжнікам.Нумар CAS Рушуі: 7732-18-5.Хімічныя рэчывы часта маюць некалькі псеўданімаў, але нумар CAS унікальны.Пры замове лекі вы можаце спачатку праверыць яго нумар CAS.

Бліжэй да дому, чаму мы павінны дакладна апісваць гэтыя рэчы?Па сутнасці, гэта яшчэ і праверка якасці экстракцыі РНК.Выкарыстанне інструментаў і набораў зробіць экстракцыю РНК больш паслядоўнай.Маштаб здабычы ў звычайных лабараторыях не вялікі, і яе можна атрымаць з дапамогай набораў.

Падрабязнасці лячэння ДНКазой або РНКазой
Важным пытаннем флуоресцентной колькаснай ПЦР з'яўляецца прадухіленне заражэння ДНК і не эксперыментуйце пры наяўнасці заражэння.Такім чынам, вельмі важна ўказаць працэс, які вы выкарыстоўвалі для апрацоўкі ДНК, каб прадэманстраваць, што ДНК у эксперыментальным працэсе была цалкам і цалкам выдалена.прадстаўлена прынцыповай схемай.

Прынцыповая схема РНК і ДНК
Увогуле, метад выдалення ДНК заключаецца ў апрацоўцы РНК ДНКазой пасля экстракцыі.Аднак гэта адносна старыя метады.Камерцыйныя наборы для экстракцыі РНК змаглі выдаліць ДНК у працэсе экстракцыі без дадання ДНКазы.Напрыклад, серыя набораў ад Foregene.

Нататка: Выдаленне ДНК падчас экстракцыі РНК - гэта вельмі небяспечны палка з двума канцамі, якая падоўжыць час экстракцыі РНК і павялічыць рызыку дэградацыі РНК.Па сутнасці, гэта кампраміс паміж выхадам РНК і чысцінёй.

Акрамя таго, колькасць ДНКазы, дададзенай у адсарбцыйную калонку на аснове дыяксіду крэмнія, вельмі малая, і для дасягнення эфекту неабходна выкарыстоўваць высакаякасную ДНКазу.Неаптымізаваная ДНКаза не можа быць перавараная хутка і цалкам.Гэта праверка тэхнічнага ўзроўню гандляра.Вядома, ёсць яшчэ больш дзіўныя гандляры, якія хваляцца, што ДНК можна выдаліць без ДНКазы.Можна сказаць, што той, хто хваліцца, што ДНК можна цалкам выдаліць без ДНКазы, - хуліган.ДНК - гэта адносна стабільная двухцепочечная структура, і яе нельга знішчыць толькі размовамі і смехам.

Ацэнка забруджанасці
метад ацэнкі: электрафарэз, 1% агароза, 6 В/см, 15 хвілін, загрузка 1-3 мкл

Колькасны аналіз нуклеінавых кіслот
звычайна вымяраецца з дапамогай УФ-спектрафатометра.Дазвольце мне спачатку папулярызаваць значэнне трох значэнняў OD260, OD280 і OD230.
·OD260 нм: гэта даўжыня хвалі паглынання самага высокага піку паглынання нуклеінавай кіслаты, а найлепшае вымеранае значэнне знаходзіцца ў дыяпазоне ад 0,1 да 1,0.Калі няма, развядзіце або сканцэнтруйце ўзор, каб давесці яго да дыяпазону.
·OD280nm: гэта даўжыня хвалі паглынання самага высокага піку паглынання бялковых і фенольных рэчываў.
·OD230nm: гэта даўжыня хвалі паглынання самага высокага піку паглынання вугляводаў.

Далей пагаворым аб ролі кожнага паказчыка.Для A260 яго можна выкарыстоўваць для вымярэння выхаду нуклеінавай кіслаты.Калі OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, РНК=40μg/ml.

Для чысціні нам трэба паглядзець на суадносіны, якія мы звычайна бачым: OD260/280 і OD260/230.
·Чыстая ДНК: OD260/280 прыкладна роўны 1,8.Калі ён большы за 1,9, гэта паказвае на забруджванне РНК, а калі менш за 1,6, гэта паказвае на забруджванне бялком і фенолам.
· Чыстая РНК: 1,7
·OD260/230: незалежна ад таго, ДНК ці РНК, эталоннае значэнне складае 2,5.Калі ён меншы за 2,0, гэта сведчыць аб наяўнасці забруджвання цукрам, соллю і арганічнымі рэчывамі.

цэласнасць РНК

Вельмі важна вымераць цэласнасць РНК.Як правіла, неабходна правесці гелевы эксперымент па дэнатурацыі РНК, каб праверыць, ці з'яўляецца яркасць паміж 28S і 18S РНК падвойнай залежнасцю.Калі з'яўляецца трэцяя паласа 5S, гэта азначае, што РНК пачала дэградаваць, за выключэннем бесхрыбтовых.

Дадзеныя для ацэнкі якасці РНК: у дадатак да вышэйпералічаных тэстаў, ёсць таксама некаторыя больш прасунутыя інструментальныя тэсты з пункту гледжання цэласнасці РНК, такія як тэст цэласнасці RQI аўтаматычнай сістэмы электрафарэзу Experion, які можа выявіць, ці незаўважна дэградуе РНК.

У навуковых даследаваннях флуоресцентная колькасная ПЦР - гэта параўнанне паміж генам-мішэнню і ўнутраным эталонным генам.Такім чынам, у працэсе захавання ўзораў РНК, экстракцыі РНК і г. д. асноўнай мэтай з'яўляецца забеспячэнне цэласнасці РНК.

Як цэласнасць РНК уплывае на баланс паміж мэтавым генам і ўнутраным эталонным генам, можна лёгка зразумець з малюнка ніжэй.Дэградацыя прывядзе да няпоўнасці гена, няхай гэта будзе няпоўнасць унутранага эталоннага гена або няпоўнасць гена-мішэні, гэта будзе мець вялікі ўплыў на дадзеныя.

Схема гена-мішэні і эталоннага гена не павінна адпавядаць рэчаіснасці

Тэст інгібіравання (ці падаўляецца значэнне CT пры высокай ці нізкай канцэнтрацыі або іншых умовах)

Прымаючы гэты малюнак у якасці прыкладу, значэнні Ct пяці крывых выглядаюць наступным чынам.Размеркаванне значэнняў CT паміж крывымі нераўнамернае, і значэння Ct затрымліваюцца пры высокіх і нізкіх канцэнтрацыях, што з'яўляецца выпадкам інгібіравання ПЦР.

Ключавы момант: у працэсе экстракцыі РНК мы павінны адмовіцца ад памылковых уяўленняў і ўсталяваць правільныя.

Памылковая думка: экстракцыя РНК імкнецца толькі да выхаду, думаючы, што чым большая колькасць атрыманай РНК, тым лепш.Фактычна, калі мы робім колькасную ацэнку, калі колькасць генаў не вельмі вялікая, нам не трэба шмат РНК.Колькасці РНК, якую вы здабываеце, больш чым дастаткова.

Правільная канцэпцыя:Экстракцыя РНК павінна быць чыстай, цэласнай і паслядоўнай.Чысціня можа гарантаваць, што наступная зваротная транскрыпцыя не інгібіруецца і дадзеныя не будуць закрануты ДНК.Цэласнасць забяспечвае баланс мэтавых паслядоўнасцей і ўнутраных спасылак.Кансістэнцыя забяспечвае стабільную загрузку ўзору.

MIQE (4) – зваротная транскрыпцыя
Памылковае ўяўленне: імкненне да большага аб'ёму выбаркі.
Правільная канцэпцыя: Дамагайцеся паслядоўнасці (стабільнасці), незалежна ад колькасці загружанай РНК, эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі застаецца пастаяннай, гарантуючы, што адрозненні ў кДНК могуць сапраўды адлюстроўваць адрозненні ў мРНК.
Мы тлумачым гэты працэс з дапамогай прынцыповай дыяграмы:

Прынцыповая дыяграма эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі не адпавядае рэчаіснасці
Перш за ўсё, мы павінны зразумець розніцу паміж працэсам зваротнай транскрыпцыі і працэсам ПЦР.ПЦР праходзіць некалькі працэсаў нагрэву і адпалу, і мэтавы фрагмент расце ў геаметрычнай прагрэсіі;у той час як зваротная транскрыпцыя не мае гэтага працэсу, мы можам сабе ўявіць, што зваротная транскрыпцыя на самай справе адзін да аднаго Падчас працэсу рэплікацыі столькі частак РНК

паколькі можна атрымаць колькі заўгодна шмат фрагментаў кДНК Інфармацыя, гэта ўжо трэба зразумець, таму што вялікія і малыя фрагменты падвяргаюцца зваротнай транскрыпцыі, і немагчыма засяродзіцца на адным фрагменце.І паколькі колькасць РНК адносна невялікая, колькасць атрыманай кДНК таксама адносна невялікая, у адрозненне ад ПЦР, якая мае эфект ампліфікацыі, таму яе практычна немагчыма выявіць.

Вынікі электрафарэзу кДНК
Па-другое, у ідэале зваротная транскрыпцыя выконваецца адзін да аднаго, але ніякая зваротная транскрыптаза любой кампаніі не можа дасягнуць гэтага эфекту.У асноўным эфектыўнасць большасці зваротных транскриптаз вагаецца ў межах 30-50%.Калі гэта так, мы аддалі перавагу б мець адносна стабільную эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі, што мы і хочам бачыць на малюнку: 3 РНК атрымліваюць 2 кДНК, 6 РНК атрымліваюць 4 кДНК, таму незалежна ад таго, колькі ўзору загружана, эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі адносна стабільная.Мы не хочам бачыць сітуацыю, калі эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі нестабільная і высокая канцэнтрацыя інгібіруецца.

Такім чынам, як праверыць, ці стабільная эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі?Метад вельмі просты, вам трэба толькі правесці тэст параўнання: адзін - зрабіць зваротную транскрыпцыю ў кДНК пасля падваення развядзення РНК, а другі - зрабіць падваенне развядзення пасля адваротнай транскрыпцыі ў кДНК, а затым зрабіць кПЦР, каб убачыць атрыманы нахіл, ці адпавядае ён.Як лепшы студэнт, вы павінны зразумець гэта за лічаныя секунды.Як паказана ніжэй:

Развядзенне РНК і кДНК для праверкі стабільнасці эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі
Зваротная транскриптаза і набор
Як ідэальная флуоресцентная колькасная ПЦР можа мець выдатную зваротную транскрыптазу і набор.Зваротная транскрыптаза ўмоўна падзяляецца на два тыпу ў залежнасці ад крыніцы: AMV абоM-MLV, і іх прадукцыйнасць такая ж, як паказана ў табліцы.

Актыўнасць РНКазы Н
РНКаза Н - гэта рыбануклеаза Н, кітайская назва - рыбануклеаза Н, якая з'яўляецца эндарыбануклеазай, якая можа спецыяльна гідралізаваць РНК у гібрыдным ланцугу ДНК-РНК.РНКаза H не можа гідралізаваць фасфадыэфірныя сувязі ў адналанцуговай або двухцепочечной ДНК або РНК, гэта значыць, яна не можа пераварыць адналанцуговую або двухцепочечную ДНК або РНК.Звычайна выкарыстоўваецца ў сінтэзе другога ланцуга кДНК.

Дзіўная рэч.Мы кажам, што зваротная транскрыптаза мае актыўнасць РНКазы Н, а не тое, што зваротная транскрыптаза змяшчае РНКазу Н, і можа быць немагчыма аддзяліць РНКазу Н ад зваротнай транскрыптазы, магчыма, з-за канфармацыі пэўных груп у зваротнай транскрыптазе. Гэтая актыўнасць выклікана зваротнай транскрыптазай.

Такім чынам, незалежна ад больш высокай эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі AMV, яго актыўнасць РНКазы Н зніжае выхад кДНК.Вядома, вытворцы рэагентаў пастаянна аптымізуюць сваю прадукцыю, каб максімальна ліквідаваць актыўнасць РНКазы Н у зваротнай транскрыптазе, каб павялічыць выхад кДНК.
Тэмпература адпалу

Другасная структура РНК пры розных тэмпературах
Глядзіце малюнак вышэй для другаснай структуры РНК пры розных тэмпературах і выкарыстоўвайце онлайн-інструмент mFold для вызначэння другаснай структуры мэтавага фрагмента пры пэўных умовах тэмпературы і канцэнтрацыі солі.Пры 55°C другасная структура РНК усё яшчэ вельмі складаная, зваротная транскрыптаза не можа працаваць, і другасная структура не можа быць цалкам вырашана да 65°C, у той час як аптымальная тэмпература AMV і M-MLV значна ніжэйшая за гэтую тэмпературу.
што рабіць?Другасная структура - гэта камплементарнае спалучэнне самой матрицы, што прыводзіць да моцнай канкурэнцыі паміж праймерам і зваротнай транскрыптазай і шаблонам, што прыводзіць да серыі праблем, такіх як нізкае Е і дрэнная паўтаральнасць.

што рабіць?Толькі максімальна павялічвайце тэмпературу адпалу.

Многія вытворцы рэагентаў паляпшаюць сваю зваротную транскрыптазу з дапамогай геннай інжынерыі.Некаторыя павялічваюць тэмпературу рэакцыі, напрыклад Джыфан і Айдэлай, а некаторыя выдаляюць актыўную групу фермента РНКазы Н, каб палепшыць сродство паміж ферментам і матрыцай РНК.Высокае сродства можа канкурэнтна выціскаць другасную структуру і плаўна прачытваць, а таксама значна павышае эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі.
Ключавы момант: зваротная транскрыпцыя больш важная для забеспячэння паслядоўнасці эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі (ферменты павінны быць не толькі эфектыўнымі, але і стабільнымі), а не колькасць загружанага ўзору, калі гэта не асабліва буйнамаштабная флуоресцентная колькасная ПЦР, яна наогул будзе немагчымая.Некалькі кДНК.
Розныя вытворцы таксама прыклалі пэўныя намаганні ў пагоні за паслядоўнасцю.Напрыклад, большасць кампаній цяпер упакавалі зваротную транскрыпцыю ў якасці стандартнага набору для продажу, што з'яўляецца добрым выбарам.
Напрыклад, наборы Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (галоўны прэмікс для камплекта для сінтэзу першай ніткі кДНК)

MIQE (5) – інфармацыя аб мэтавым гене

Малюнак вышэй тлумачыць
1. Ці эфектыўны гэты ген для паўторных эксперыментаў, звычайна можна праверыць паўторнымі эксперыментамі.
2. Gene ID, вы ведаеце.
3. Даўжыня гена, агульная даўжыня мэтавага гена, безумоўна, не праблема.Пры распрацоўцы праймераў пераканайцеся, што даўжыня амплікону складае 80-200 п.о., каб забяспечыць лепшую эфектыўнасць ампліфікацыі.
4. Інфармацыя аб параўнанні паслядоўнасці Blast, мэтавы ген неабходна параўнаць у генным банку, каб прадухіліць неспецыфічную ампліфікацыю.
5. Наяўнасць псевдогенов.Псеўдаген - гэта паслядоўнасць ДНК, падобная да звычайнага гена, але губляе сваю нармальную функцыю.Ён часта існуе ў шматгеннай сям'і эўкарыёт.Звычайна ён пазначаецца ψ.Гэта нефункцыянальная копія геномнай ДНК у геноме, якая вельмі падобная на паслядоўнасць кадавальнага гена., звычайна не транскрыбуюцца і не маюць выразнага фізіялагічнага значэння.
6. Размяшчэнне праймераў адносна Экзон і інтронаў.У першыя гады, калі мы вырашалі праблему забруджвання ДНК, мы часта звярталі ўвагу на размяшчэнне праймераў, экзонаў і інтронаў і звычайна разглядалі магчымасць распрацоўкі праймераў паміж інтронамі, каб пазбегнуць ампліфікацыі ДНК.Калі ласка, глядзіце малюнак ніжэй: чорны ўяўляе інтроны, розныя сінія ўяўляюць экзоны, ружовы ўяўляе звычайныя праймеры, а ярка-чырвоны ўяўляе праймеры, якія ахопліваюць інтроны.

Схематычна, ніколі не праўда
Якім гэта выглядае ідэальным планам, але насамрэч у большасці выпадкаў транс-інтронныя праймеры не такія чароўныя, як сабе ўяўляюць, і яны таксама выклікаюць неспецыфічнае ўзмацненне.Такім чынам, лепшы спосаб прадухіліць заражэнне ДНК - гэта поўнае выдаленне ДНК.
7. Канфармацыйнае прагназаванне.Зноў выкарыстоўваючы гэты прыклад, выкарыстоўвайце онлайн-інструмент mFold, каб вызначыць другасную структуру мэтавага фрагмента пры пэўнай тэмпературы і канцэнтрацыі солі.

Другасная структура РНК пры розных тэмпературах
Другасная структура - гэта камплементарнае спалучэнне самога шаблону, што прывядзе да моцнай канкурэнцыі паміж праймерам і спалучэннем шаблону, і шанцы на звязванне праймера менш, што прывядзе да шэрагу праблем, такіх як нізкі E і дрэнная паўтаральнасць.З дапамогай прагназавання праграмнага забеспячэння, калі няма праблемы другаснай структуры, гэта было б выдатна.Калі ёсць, наш наступны артыкул будзе канкрэтна абмяркоўваць, як вырашыць гэтую праблему.

MIQE (6)—алігануклеатыды кПЦР

Для флуоресцентной колькаснай ПЦР першае, з чым вы змагаецеся кожны дзень, - гэта вылучэнне РНК, а другое, што можа быць распрацоўка праймера.
Перш за ўсё, мы па-ранейшаму правяраем правілы дызайну грунтоўкі ў адпаведнасці з кантрольным спісам MIQE.Гэта так проста, што адмарозкі могуць пасмяяцца, а мы можам скончыць адным сказам: высветліць паслядоўнасць і становішча праймер-зонда і спосаб мадыфікацыі.Што тычыцца метаду ачысткі праймера, сінтэз праймера ў цяперашні час вельмі танны, qPCR варты метадаў ачысткі PAGE і вышэй, а інфармацыя пра прыбор для сінтэзу не важная.Многія людзі дзесяцігоддзямі займаюцца праймерамі і не ведаюць, што сінтэзатарам з'яўляецца ABI3900.
Што тычыцца прынцыпаў распрацоўкі буквароў, вам неабавязкова запамінаць іх на памяць, таму што большасць праграм для распрацоўкі буквароў або інтэрнэт-інструментаў могуць вырашыць гэтыя праблемы (рэкамендаваны онлайн-інструмент primer3.ut.ee/), і 99,999% распрацоўкі буквароў не робіцца ўручную. Паглядзіце, аўтар часам распрацоўвае сотні буквароў у дзень, калі вы будзеце чытаць адзін за адным, гэта стане касавокім.
Проста праверце наступныя моманты пасля распрацоўкі праймераў:
1. Распрацуйце праймеры, блізкія да 3'-канца: у выпадку выкарыстання аліга-dT-праймераў для сінтэзу першага ланцуга кДНК, улічваючы эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі і цэласнасць РНК, распрацаваныя праймеры павінны быць распрацаваны блізка да 3'-канца, каб палепшыць эфектыўнасць ампліфікацыі.Выкарыстоўвайце малюнак, каб растлумачыць наступнае (гэта немагчыма зразумець):

Чаму праймеры павінны быць распрацаваны бліжэй да 3'-канца, гэта не павінна быць праўдай
2. Значэнне TM: значэнне Tm знаходзіцца пры тэмпературы 55-65°C (паколькі актыўнасць экзануклеазы найбольш высокая пры 60°C), а ўтрыманне GC складае 40%-60%.
3. BLAST: каб пазбегнуць неспецыфічнай ампліфікацыі геному, Blast неабходна выкарыстоўваць для дадатковай праверкі.

MIQE(7)—працэс кПЦР

1. Камплект qPCR
Згодна з патрабаваннямі MIQE, у артыкуле мы павінны дакладна апісаць поўныя ўмовы рэакцыі, уключаючы канфігурацыю рэакцыйнай сістэмы ПЦР, які набор выкарыстоўваецца, хто з'яўляецца вытворцам, наколькі вялікая рэакцыйная сістэма, ці выкарыстоўваецца метад фарбавальніка або метад зонда, налады праграмы ПЦР.Вадзіцелі-ветэраны напэўна выявяць, што пры выбары камплекта вышэйзгаданая інфармацыя ў асноўным вызначаецца.
У цяперашні час выраб і вытворчасць флуоресцентных набораў для колькаснай ПЦР з'яўляецца вельмі спелай тэхналогіяй.Пакуль вы не выбіраеце вельмі дрэнных вытворцаў, верагоднасць праблем невялікая, але мы ўсё ж хочам падзяліцца з вамі некаторымі момантамі:
Фермент Taq гарачага старту:Найбольш важнай часткай ПЦР з'яўляецца гарачы стартавы фермент Taq.Ферменты гарачага старту на рынку звычайна дзеляцца на два тыпы: адзін - гэта хімічна мадыфікаваны фермент гарачага старту (вы можаце ўявіць яго як заліванне ў парафін), а другі - фермент гарачага старту для мадыфікацыі антыцелаў (звязванне антыген-антыцелы).Хімічная мадыфікацыя з'яўляецца раннім спосабам гарачага запуску ферментаў.Пры дасягненні пэўнай тэмпературы фермент выпусціць сваю актыўнасць.Мадыфікаваны антыцеламі фермент гарачага старту выкарыстоўвае біялагічныя метады для блакавання актыўнасці фермента.Калі дасягаецца пэўная тэмпература, антыцелы дэнатуруюцца і інактывуюцца ў выглядзе бялку, і актыўнасць фермента ўключаецца ў дзеянне.

Аднак якая з гэтага карысць?Гэта так, актыўнасць вызвалення мадыфікаваных антыцелаў ферментаў адбываецца хутчэй, чым актыўнасць хімічна мадыфікаваных ферментаў, таму з пункту гледжання адчувальнасці ферменты, мадыфікаваныя антыцеламі, маюць невялікую перавагу, так што ў наборах на рынку практычна няма хімічна мадыфікаваных ферментаў.Калі і ёсць, то тэхналогія гэтага вытворцы ўсё яшчэ затрымалася ў эпосе тысячагоддзяў.
Канцэнтрацыя іёнаў магнію:Канцэнтрацыя іёнаў магнію вельмі важная ў рэакцыі ПЦР.Адпаведная канцэнтрацыя іёнаў магнію можа спрыяць вызваленню актыўнасці фермента Taq.Калі канцэнтрацыя занадта нізкая, актыўнасць фермента будзе значна зніжана;калі канцэнтрацыя занадта высокая, катализируемое ферментам неспецыфічнае ўзмацненне будзе ўзмоцнена.Канцэнтрацыя іёнаў магнію таксама будзе ўплываць на адпал праймераў, тэмпературу плаўлення матрыцы і прадуктаў ПЦР, уплываючы тым самым на выхад амплифицированных фрагментаў.Канцэнтрацыя іёнаў магнію звычайна кантралюецца на ўзроўні 25 мМ.Вядома, для добрага камплекта неабходна добра кантраляваць канцэнтрацыю іёнаў магнію.Некаторыя гандляры дадаюць у рэагент хелатирующий агент іёнаў магнію, які дазваляе дасягнуць эфекту аўтаматычнага рэгулявання канцэнтрацыі іёнаў магнію.
Канцэнтрацыя флуоресцентного фарбавальніка:Флуарэсцэнтны фарбавальнік, які з'яўляецца зялёным SYBR Green, які мы звычайна выкарыстоўваем, у асноўным стварае флуарэсцэнцыю, звязваючыся з малой баразёнкай двухланцуговай ДНК, таму што звязванне фарбавальніка з двухланцуговай ДНК неспецыфічнае, гэта значыць, пакуль двухланцуговая ДНК спалучаецца з ім, можа адбывацца флуарэсцэнцыя, таму праймеры-дымеры і шаблоны ДНК у сістэме будуць спалучацца з ім, ствараючы фонавы сігнал .
PS: дзякуючы сваім святлоадчувальным уласцівасцям прадукты на рынку звычайна пакуюцца ў карычневыя непразрыстыя цэнтрыфужныя прабіркі (як паказана на малюнку ніжэй).Аднак гэта сутыкнецца з праблемай.Пры адборы цяжка ўбачыць, ці ўсмоктваецца вадкасць.У гэтым плане Qingke сапраўды найбольш зручны (як паказана на малюнку ніжэй), а празрысты цюбік запакаваны ў непразрысты бляшаны пакет.Затым змесціце яго ў бляшаны пакет, прымаючы пад увагу зручнасць пазбягання святла і ўзяцця проб.Вы павінны выбраць правільны нумар прадукту.TSE204 - гэта вельмі эканамічнае існаванне, якое прымушае мяне саджаць траву.

Канцэнтрацыя флуоресцентного фарбавальніка таксама вельмі важная.Калі канцэнтрацыя занадта нізкая, крывая ампліфікацыі не будзе расці на больш позняй стадыі і не будзе ідэальнай;калі канцэнтрацыя занадта высокая, гэта выкліча шумавыя перашкоды.Паколькі флуоресцентная колькасная ПЦР у асноўным залежыць ад значэння КТ, калі канцэнтрацыя флуоресцентного фарбавальніка не адрэгулявана належным чынам, нізкая кропка лепш, чым высокая.Вядома, адпаведная канцэнтрацыя фарбавальніка з'яўляецца лепшай.

РОКС: Фарбавальнікі ROX выкарыстоўваюцца для карэкцыі памылак сігналу флуарэсцэнцыі ад лункі да лункі.Некаторыя вытворцы прыбораў патрабуюць каліброўкі, а іншыя - не.Напрыклад, выкарыстанне прыбора ПЦР у рэжыме рэальнага часу ад Thermo Fisher Scientific звычайна патрабуе каліброўкі, у тым ліку 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus і г. д. Гэта апісваецца ў агульных інструкцыях да набору.
Сумесь qPCR ад Foregene таксама змяшчае фарбавальнік ROX, які зручны для выкарыстання ў розных мадэлях.

Набор для ПЦР у рэжыме рэальнага часу - Taqman

Лячэнне слабой вадароднай сувяззю: Лячэнне слабых вадародных сувязяў - адносна тэхнічная справа.Нічога не чытаў інструкцыі многіх набораў, але ні ў адным з іх не згадвалася гэтая тэма.На самай справе гэта так важна.Спалучэнне асноў у асноўным залежыць ад трываласці вадародных сувязей.Моцныя вадародныя сувязі з'яўляюцца нармальным узмацненнем, а слабыя вадародныя сувязі прыводзяць да неспецыфічнага ўзмацнення.Калі слабыя вадародныя сувязі немагчыма добра ліквідаваць, нельга пазбегнуць неспецыфічнага ўзмацнення.У межах працы аўтара толькі некалькі кампаній заўважылі гэтую праблему.Калі вы купляеце камплект, вы можаце пазначыць, ці разглядалі вы рашэнне ў гэтым плане для камплекта, які хочаце выбраць.

Аб'ём рэакцыі: Сістэма 20-50 мкл выкарыстоўваецца часцей, і меншыя аб'ёмы могуць выклікаць памылкі.Наогул кажучы, у інструкцыях да набору будзе рэкамендавана выкарыстанне аб'ёмаў рэакцыі ПЦР.Не будзьце разумнымі і выкарыстоўвайце меншыя аб'ёмы, каб зэканоміць выдаткі.мэта ст.Аб'ём, рэкамендаваны прадаўцамі, сапраўды быў правераны, і можа быць, што яны не могуць вырашыць праблему памылак, выкліканых невялікімі аб'ёмамі.
2. Вытворца і артыкул пласціны
Усім вядомы прынцып флуоресцентной колькаснай ПЦР.Збор флуарэсцэнцыі ў асноўным ажыццяўляецца праз каўпачкі прабірак для ПЦР.Пры выбары расходных матэрыялаў для ПЦР звяртайце ўвагу на два моманты: добрую святлопранікальнасць і прыдатнасць да прыбора.Увогуле, платы і трубкі асноўных брэндаў падыходзяць, але трэба ўважліва выбіраць з пункту гледжання адаптацыі, інакш вы не зможаце выкарыстоўваць інструмент.

4. Веданне вышэйшага ўзроўню

MIQE (8)—праверка qPCR
Гэта галоўны прыярытэт КПЦР!Столькі герояў тут патрапіла ў пясок.Вядома, таксама магчыма, што вам пашанцавала і гены, якія вы вывучылі, простыя, таму вы плылі па ледзяной пячоры па ветру.Інфармацыя праверкі qPCR прызначана для праверкі надзейнасці даных.Мы пералічваем неабходную інфармацыю праверкі наступным чынам:

1. Тэст на спецыфіку
Спецыфічнасць ампліфікацыі гена-мішэні правяраюць, правяраючы, ці з'яўляецца карціна электрафарэзу адной паласой;праверка паслядоўнасці;крывая плаўлення, каб убачыць, ці адна карта пікаў;праверка ферментнага стрававання і іншыя метады.
Тут мы сканцэнтруемся на tаналіз неспецыфічнага ўзмацнення метадам крывых плаўлення.Наогул кажучы, калі мы распрацоўваем праймеры, памер фрагмента прадукту павінен быць у дыяпазоне 80-200 bp, што робіць тэмпературу плаўлення прадукту ПЦР у дыяпазоне 80-85 °C.Такім чынам, калі ёсць розныя пікі, павінны быць і іншыя неспецыфічныя прадукты ўзмацнення;калі пік з'яўляецца ніжэй за 80°C, гэта звычайна лічыцца дымерам грунтоўкі;калі пік з'яўляецца вышэй за 85°C, гэта звычайна лічыцца забруджваннем ДНК або больш неспецыфічнай ампліфікацыяй вялікіх фрагментаў.
Заўвага: часам бывае толькі адзін пік пры 80°C.У гэты час гэтай канцэпцыі трэба прытрымлівацца.Цалкам верагодна, што ўсе вынікі ампліфікацыі - гэта дымеры грунтоўкі.

Нармальная крывая плаўлення (адзіночны пік без неспецыфічнага ўзмацнення)

Праблемная крывая плаўлення (неспецыфічнае ўзмацненне ілжывых пікаў)
【Аналіз справы】

Ёсць асноўны пік, але грунтоўны дымер сур'ёзны
Аднапікавая крывая плаўлення на малюнку ніжэй можа лёгка падмануць вашы вочы, падумаўшы, што гэта ідэальны эксперымент, але вынік цалкам памылковы.У гэты час мы павінны глядзець на тэмпературу плаўлення.Пікавая тэмпература ніжэй за 80°C, што цалкам з'яўляецца праймерам.

Няма мэтавага фрагмента, усе праймеры
Тут брат не можа спыніцца.На малюнку ніжэй фота, зробленае на мабільны тэлефон, які мне даслаў падонак.Рэагенты, якія ён выкарыстаў, належаць да брэндаў, якія звычайна выкарыстоўваюцца ў прамысловасці.Ён перайшоў з адной маркі з прыстаўкай Т на іншую.Думаю, вы ўжо здагадаліся.Падонак закрычаў мне: «Рэактыў на першым здымку занадта добры, а пік адзінкавы.Пазней, пасля выкарыстання рэактыва, які вы рэкамендавалі, ён становіцца падобным на другі малюнак са змешанымі пікамі.Вы зрабілі мяне няшчасным.«
Раздзяліце дзве графы.На першы погляд, адзін мае адзінарны пік, а другі - двайны.Глупства, адна вяршыня, вядома, нармальна.Гэта праўда?
Горш, чым Dou E, калі я змясціў дзве выявы на малюнку ніжэй, вы адразу зразумееце.Насамрэч, такая карціна нас лёгка паралізуе.Пасля ўважлівага аналізу мы выявілі, што: пік першай лічбы знаходзіцца пры 75°C, што цалкам адпавядае дымеру грунтоўкі;пік другой фігуры з'яўляецца пры 75°C і 82°C, па меншай меры, ёсць Прадукт з'яўляецца.

Карцінкі водгукаў студэнтаў
Такім чынам, фундаментальная праблема - гэта не праблема рэагентаў, а праблема дызайну грунтоўкі.У той жа час, гэта таксама даказвае, што некаторыя буйныя брэнды не маюць якасці жалеза, і гэта таксама даказвае тое, што мой брат казаў раней: гэта не марка рэагентаў, якая падтрымлівае ваш артыкул.Гэта ваш артыкул падмацаваў марку рэагентаў.Толькі ўявіце, калі б падонак не змяніў рэактывы, у журнал патрапілі б няправільныя дадзеныя, і здарылася б трагедыя.
2. Значэнне Ct пустога кантролю
Не тлумачыце, калі пусты кантроль мае значэнне Ct, гэта не забруджванне?Аднак вам усё роўна трэба зразумець, які пусты элемент кіравання мае значэнне Ct.Калі гэта NTC, гэта азначае, што ёсць чужародная ДНК, напрыклад, забруджванне рэагентам.Калі гэта NRT, гэта азначае, што вынятая РНК мае забруджванне ДНК.
3. Стандартная крывая
Уключаючы нахіл і формулу разліку, эфектыўнасць ПЦР можна разлічыць па формуле.Ідэальны эксперымент патрабуе, каб нахіл стандартнай крывой набліжаўся да 3,32, а R² - да 0,9999.
4. Лінейны дынамічны дыяпазон
Дынамічны дыяпазон рэакцыі лінейны.У адпаведнасці з шаблонам, які выкарыстоўваецца для стварэння стандартнай крывой, дынамічны дыяпазон павінен уключаць не менш за 5 градыентаў канцэнтрацыі і звяртаць увагу на змяненне значэнняў Ct пры высокіх і нізкіх градыентах канцэнтрацыі.
5. Дакладнасць выяўлення
Змены ў выніках кПЦР, гэта значыць дрэнная паўтаральнасць, гэта значыць нізкая дакладнасць, выкліканы многімі фактарамі, уключаючы тэмпературу, канцэнтрацыю і працу.Дакладнасць qPCR звычайна становіцца менш кантраляванай па меры змяншэння колькасці копій.У ідэале ўнутрыэксперыментальная варыяцыя, гэтая тэхнічная варыяцыя павінна адрознівацца ад біялагічнай варыяцыі, і біялагічныя копіі могуць непасрэдна вырашаць статыстычныя адрозненні ў выніках кПЦР паміж групамі або метадамі лячэння.У прыватнасці, для дыягнастычных аналізаў неабходна паведамляць пра найлепшую дакладнасць паміж аналізамі (паўтаральнасць) на сайтах і аператарах.
6. Эфектыўнасць выяўлення і LOD (у мультыплекснай кПЦР)
LOD - гэта самая нізкая канцэнтрацыя з 95% выяўленых станоўчых узораў.Іншымі словамі, канцэнтрацыя LOD, якая змяшчаецца ў наборы паўтораў гена-мішэні, не павінна перавышаць 5% няўдалых рэакцый.Пры выкананні мультыплекснага аналізу qPCR, асабліва для адначасовага выяўлення кропкавых мутацый або палімарфізмаў, мультыплексная qPCR павінна даць доказ таго, што дакладнасць некалькіх мэтавых фрагментаў не парушана ў адной прабірцы, эфектыўнасць выяўлення некалькіх і адной прабіркі і LOD павінны быць аднолькавымі.На гэтую праблему неабходна звярнуць увагу, асабліва калі гены-мішэні з высокай канцэнтрацыяй і гены-мішэні з нізкай канцэнтрацыяй адначасова ўзмацняюцца.
Праблемы і рашэнніНаогул кажучы, праблемы, якія часта сустракаюцца пры адладцы qPCR, засяроджваюцца на наступных аспектах:
·неспецыфічнае ўзмацненне
·Цяжкі выбар канцэнтрацыі праймераў і праблемы з праймерамі-дымерамі
· Тэмпература адпалу недакладная
·Другасная структура ўплывае на эфектыўнасць узмацнення
неспецыфічныя ўзмацненне
неспецыфічнае ўзмацненне, звычайна разглядаецца пытанне аб непрыдатнасці грунтоўкі, але калі вы не спяшаецеся мяняць грунтоўкі, вы можаце спачатку паспрабаваць наступныя метады (прынцып таксама прыкладаецца):
·Павялічце тэмпературу адпалу – паспрабуйце зрабіць так, каб слабыя вадародныя сувязі не маглі падтрымлівацца;
· Скараціць час адпалу і падаўжэння - паменшыць верагоднасць слабых вадародных сувязяў;
· Паменшыць канцэнтрацыю праймераў - знізіць верагоднасць звязвання лішніх праймераў і нямэтавых абласцей;
Нізкая эфектыўнасць узмацнення
Сітуацыя, супрацьлеглая неспецыфічнай ампліфікацыі, - нізкая эфектыўнасць узмацнення, і меры па барацьбе з нізкай эфектыўнасцю ўзмацнення прама супрацьлеглыя:
·Падоўжыць час адпалу і падаўжэння;
·Пераход на трохэтапную ПЦР і зніжэнне тэмпературы адпалу;
·Павышэнне канцэнтрацыі грунтоўкі;
Ps: Многія аспіранты, якія нарадзіліся ў 90-х, не жадаюць вывучаць, як адладжваць эксперыменты, і спадзяюцца, што набор можа цалкам вырашыць праблему (калі вы хочаце пайсці ў кампанію па вытворчасці рэагентаў для правядзення даследаванняў і распрацовак пасля заканчэння вучобы). Фактычна, вытворцы рэагентаў таксама думаюць так, я спадзяюся, што гэта дурань. Яго можна выкарыстоўваць, калі вы яго атрымаеце, таму вытворцы рэагентаў прыклалі шмат намаганняў, каб вырашыць праблему неспецыфічнага ўзмацнення, уключаючы ўвядзенне слабога H-bon г фактары паглынання.Каб лёгка вырашыць праблему, дурням усё роўна трэба прачытаць увядзенне кампаніі-вытворцы рэагентаў, каб даведацца, ці ёсць фактар, які паглынае слабыя вадародныя сувязі.
Цяжкі выбар канцэнтрацыі праймераў і праблемы з праймерамі-дымерамі
Спосаб 1: Наогул кажучы, у інструкцыях па наборы для кПЦР ёсць рэкамендаваныя сістэмы і рэкамендаваныя канцэнтрацыі праймераў.
Спосаб 2: Адладка шляхам усталявання градыенту канцэнтрацыі грунтоўкі.Фота ніжэй скрадзена ў кампаніі для ілюстрацыі.На малюнку ніжэй паказаны колькасныя вынікі флуарэсцэнцыі, атрыманыя з дапамогай трох градыентаў канцэнтрацыі праймера (100 нМ, 250 нМ, 500 нМ) і чатырох шаблонных градыентаў канцэнтрацыі (0,1 нг, 1 нг, 10 нг, 100 нг).Значэнне Ct вынікаў эксперыменту адлюстроўваецца наступным чынам:

Выбар канцэнтрацыі праймера Злучыце кожную канцэнтрацыю праймера ў радок наступным чынам:

Выбар канцэнтрацыі праймера відавочны, лінейная залежнасць канцэнтрацыі праймера 100 нМ і 250 нМ лепш, а лінейная залежнасць канцэнтрацыі праймера 500 нМ адносна дрэнная.У 100 нМ і 250 нМ значэнне Ct 250 нМ адносна невялікае, таму аптымальная канцэнтрацыя праймера складае 250 нМ.Як правіла, сур'ёзныя праймеры-дымеры можна ўбачыць на крывой плаўлення.Што рабіць, калі распрацаваныя праймеры не могуць пазбегнуць праймераў-дымераў?
Спосаб 3: Паменшыць колькасць праймераў і павялічыць тэмпературу адпалу (не трэба тлумачыць).
Эмпірычнае значэнне тэмпературы адпалу складае 60°C.Калі вы не ўпэўненыя, як выбраць больш прыдатную тэмпературу адпалу?Адказ такі ж, як і выбар канцэнтрацыі праймера -градыентны тэст.Вазьміце фота кампаніі Bio-rad, каб праілюстраваць праблему.Для ампліфікацыі пэўнага мэтавага фрагмента задаюць восем тэмпературных градыентаў, кожны з трох паўтораў, і атрыманая крывая ампліфікацыі выглядае наступным чынам:

выбар тэмпературы адпалу:
·70°C, 69°C—у прынцыпе, праймеры нельга камбінаваць, таму ўзмацнення няма.
·67,3°C – у пачатку назіраецца невялікае ўзмацненне, а значэнне Ct адносна вялікае.
·64,5°C——Зніжэнне Ct.
·Пры 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C і 55,0°C значэнні Ct у асноўным былі стабільнымі, але канчатковыя значэнні флуарэсцэнцыі адрозніваліся.
Як абраць?Прынцып: першы прынцып - больш высокае значэнне Ct.Для таго ж значэння Ct выбірайце больш высокую тэмпературу адпалу, каб пазбегнуць дымерызацыі і неспецыфічнага ўзмацнення.Нягледзячы на ​​тое, што значэнне флуарэсцэнцыі вышэй за 55°C, у ім могуць быць дымеры або неспецыфічнае ўзмацненне.
Але калі вы такія ж разумныя, як вы, вы абавязкова падумаеце: лагічна кажучы, калі рэакцыя ПЦР вельмі спецыфічная, пакуль канцэнтрацыя праймера перавышае мінімальныя патрабаванні, высокія і нізкія кропкі не павінны мець ніякага эфекту, як і флуоресцентные фарбавальнікі і dNTP.Сапраўды, пакуль тэмпература адпалу аптымізавана належным чынам, уплыў канцэнтрацыі грунтоўкі на значэнне Ct, натуральна, будзе зведзены да мінімуму.

Тэмпература адпалу аптымізавана належным чынам, і ўплыў канцэнтрацыі грунтоўкі на КТ будзе зведзены да мінімуму
Другасная структура ўплывае на эфектыўнасць узмацнення
Давайце возьмем здымак з Bio-rad, каб праілюстраваць праблему.Ён таксама распрацоўвае тэмпературны градыент для ампліфікацыі гена з другаснай структурай.

Узнікае другасная структура
Можна заўважыць, што па меры памяншэння градыенту тэмпературы пачынаюць з'яўляцца прадукты і значэнне Ct рухаецца наперад, дасягаючы мінімальнага значэння пры 60,7°C, а затым, калі градыент тэмпературы памяншаецца, значэнне Ct становіцца большым.І наадварот, з павышэннем тэмпературы другасная структура раскрываецца і эфектыўнасць узмацнення павялічваецца.Пасля дасягнення пэўнай тэмпературы павышэнне тэмпературы не можа палепшыць эфектыўнасць узмацнення.Таму што ў цяперашні час праймеры немагчыма стабільна спалучаць.таму,шукайце тэмпературу з самым нізкім значэннем Ct, якая з'яўляецца найлепшай тэмпературай для ўзмацнення шаблону другаснай структуры!Вядома, разумныя дурні павінны ведаць, што калі ў гэтым няма неабходнасці, лепш за ўсё змяніць праймеры і пазбягаць вобласці другаснай структуры.
5. Прыкладны ўзровень
MIQE—Аналіз даных

Аналіз дадзеных у асноўным даецца флуоресцентным колькасным прыборам ПЦР.У папярэднім артыкуле было зроблена шмат працы па аналізе даных, напрыклад, пусты кантроль, які быў растлумачаны ў дызайне эксперыменту.Унутраныя эталонныя гены, нумары паўтораў і г.д. былі ўдакладнены., тут мы ў асноўным тлумачым прымяненне кПЦР.
КПЦР шырока выкарыстоўваецца, а эксперыментальная праверка і дыягностыка нуклеінавых кіслот з'яўляюцца найбольш часта выкарыстоўванымі сцэнарыямі.
абсалютная колькасная ацэнка
Log (пачатковая канцэнтрацыя) мае лінейную залежнасць ад колькасці цыклаў.Стандартную крывую можна пабудаваць з стандарту з вядомым пачатковым нумарам копіі, гэта значыць можна атрымаць лінейную залежнасць рэакцыі ампліфікацыі.У адпаведнасці са значэннем Ct ўзору можна разлічыць канцэнтрацыю ў пробе.Колькасць шаблонаў для ўключэння.

Абсалютны колькасны метад разліку
Абсалютная колькасная ацэнка павінна грунтавацца на стандартнай крывой.Каб зрабіць стандартную крывую, патрабуецца эталон.Звычайна стандартам з'яўляецца плазмида, атрыманая шляхам кланавання гена-мішэні.Чаму гэта плазміда?Таму што кальцавая плазмидная ДНК найбольш стабільная.Развядзіце стандартны прадукт ад 5 да 6 градыентаў у адпаведнасці з каэфіцыентам падваення (10-кратнае развядзенне), звяртаючы ўвагу на аднастайнасць пры развядзенні.Няхай значэнне Ct апусціцца ў межах 15-30.

Стандартная падрыхтоўка
У той жа час, узор для тэставання таксама павінен быць разведзены адпаведным чынам (памятайце каэфіцыент развядзення), і значэнне Ct таксама павінна знаходзіцца ў межах 15-30.Стандартны прадукт + узор для выпрабаванняў ставяцца на машыну разам.Пасля прагону была зроблена стандартная крывая са стандартным рэчывам, і ўзоры, якія падлягаюць тэсціраванню, былі ўведзены ў стандартную крывую для разліку канцэнтрацыі.
Колькаснае вызначэнне віруса гепатыту B HBV - гэта тыповая абсалютная колькасная ацэнка, якая дазваляе вылічыць колькасць копій віруса ў 1 мл крыві.
Разлік колькасці копій
Канцэнтрацыя ўзору для тэставання (нг/мкл) = OD260 × 50 мкг/мл × каэфіцыент развядзення
Малекулярная маса ўзору = колькасць асноў × 324
Колькасць копій узору для тэсціравання (копій/мкл) = канцэнтрацыя ўзору для тэсціравання / малекулярная маса ўзору × 6 × 1014

Спосаб разліку колькасці асобнікаў

Вышэй прыведзены метад разліку для вызначэння колькасці.Гэта матэматычная задача, якую можна рашаць пасля заканчэння малодшай школы, а матэматычныя задачы ўвогуле вырашаюць камп’ютары.Калі не разумееш, можаш прыйсці пагутарыць.
адносная квантыфікацыя
Адносная квантыфікацыя ў асноўным выкарыстоўваецца ў навуковых даследаваннях.Колькі вірусаў змяшчаецца ў 1 мл крыві, і гэта ДНК-вірус, гэта адносна дэтэрмінаваная падзея: можна вызначыць колькасць крыві, і ДНК-вірус адносна стабільны.Аднак нам цяжка параўноўваць колькасць копій транскрыпцыі пэўнага гена ў лісце, таму што цяжка вызначыць памер, вагу і пяшчоту ліста, колькасць вынятай РНК цяжка вызначыць, і эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі таксама цяжка вызначыць, гэта значыць, любы крок можа прывесці да таго, што ў эксперыментальных дадзеных будуць памылкі і іх нельга выкарыстоўваць.
Такім чынам, адносная колькасная ацэнка павінна ўвесці элемент:ўнутраны эталонны ген.
Іншымі словамі, адносная колькасная ацэнка - гэта фактычна параўнанне паміж мэтавым генам і ўнутраным эталонным генам.У параўнанні з той жа тканінай і той жа клеткай, уплыў памеру ўзору, колькасці экстракцыі РНК, эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі і эфектыўнасці ПЦР адносна невялікі.З-за невялікага памеру выбаркі як унутраныя эталонныя гены, так і гены-мішэні былі адносна зменшаны.Таму мы раней рабілі акцэнт на аднастайнасці і стабільнасці.
Унутраныя эталонныя гены, як правілагены хатняй гаспадаркі(гены гаспадарання), якія адносяцца да класа генаў, якія стабільна экспрессируются ва ўсіх клетках, і іх прадукты неабходныя для падтрымання асноўнай жыццядзейнасці клетак.
Не блытайце гэта паняцце.Гены хатняй гаспадаркі - гэта тэрміны біялагічных функцый, у той час як унутраныя эталонныя гены - гэта эксперыментальныя тэхнічныя тэрміны.Гены гаспадаркі павінны прайсці праверку, перш чым іх можна будзе выбраць у якасці ўнутраных эталонных генаў.
Напрыклад, мы абралі некалькі генаў хатняй гаспадаркі на малюнку ніжэй, каб праверыць узровень іх экспрэсіі ў клетках розных тканак, і выявілі, што ўзроўні экспрэсіі β-2-мікраглабуліну значна адрозніваюцца ад узроўняў астатніх трох генаў, таму іх нельга выкарыстоўваць у якасці ўнутраных эталонных генаў.

Пасля разумення карэкцыйнай функцыі ўнутранага эталоннага гена, у выніку ўвядзення ўнутранага эталоннага гена атрыманы два алгарытмы.
·метад падвойнай стандартнай крывой
·2 – метад △△Ct (метад параўнання значэнняў CT)
Калі вы зацікаўлены ў вывучэнні відаў і функцый генаў, калі ласка, адмоўцеся ад даследаванняў алгарытмаў і выкарыстоўвайце формулы непасрэдна або выкарыстоўвайце машыны непасрэдна;калі вы натуралістычны чалавек у матэматыцы і інжынерыі, не саромейцеся.
метад двайны стандартнай крывой
Вызначце колькасны ген-мішэнь і ген хатняй гаспадаркі кантрольнага ўзору і ўзору для тэсціравання праз стандартную крывую, а затым вылічыце адноснае значэнне ў адпаведнасці з формулай разліку, якое з'яўляецца адносным узроўнем экспрэсіі.
Перавагі: просты аналіз, адносна простая эксперыментальная аптымізацыя
Недахоп: для кожнага гена кожны раунд эксперыментаў павінен складаць стандартную крывую
Ужыванне: адзін з двух найбольш часта выкарыстоўваюцца і прызнаных адносных колькасных метадаў у вывучэнні рэгуляцыі экспрэсіі генаў
Формула такая:

Прыклады наступныя:

Разлічыце адносную колькасць на падставе колькаснага выніку
2 – метад △△Ct (метад параўнання значэнняў CT)

Перавагі: Няма неабходнасці рабіць стандартную крывую
Недахопы: Мяркуецца, што эфектыўнасць узмацнення блізкая да 100%;стандартнае адхіленне складае <5%, а стандартная крывая і эфектыўнасць паміж кожным узмацненнем лічацца паслядоўнымі;аптымізацыя эксперыментальных умоў больш складаная.
Ужыванне: адзін з двух найбольш часта выкарыстоўваюцца і прызнаных адносных колькасных метадаў у вывучэнні рэгуляцыі экспрэсіі генаў

Вядома, эфектыўнасць ампліфікацыі звычайна немагчыма быць ідэальна роўнай 1. Метад карэкцыі: калі мы ведаем, што мэтавы ген і эталонны ген маюць аднолькавую эфектыўнасць ампліфікацыі, але эфектыўнасць ампліфікацыі не роўная 1, тады 2－△△Ct можна выправіць як: (1+E )－△△Ct, напрыклад, калі эфектыўнасць ампліфікацыі роўная 0,95, то формулу разліку можна выправіць на 1,9 5－△△Ct
На дадзены момант змест пра флуоресцентную колькасную ПЦР падышоў да канца.