Калонку заглушылі

Пасля закаркавання калонкі выхад РНК зніжаецца або нават немагчыма ачысціць РНК, і атрыманая маса РНК нізкая.

Аналіз агульных прычын:

1. Разрывы выбаркі не з'яўляюцца дбайнымі.

Паломка ўзору не прыводзіць да поўнай блакіроўкі КАЛОНКІ ДЛЯ АЧЫСТКІ ДНК, уплываючы на ​​выхад і якасць РНК.Мы рэкамендуем хуткую аперацыю драбнення ў дастатковай колькасці вадкага азоту, калі вы зламалі ўзоры. Паспрабуйце раздушыць клеткавую сценку ўзору, клеткавую мембрану і іншую тканіну.Для раслінных узораў полиольных поліцукрыдаў мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Пры адсмоктванні аддзеленага супернатанта ўзору з дапамогай калонкі для ачысткі ДНК можна ўдыхнуць магчымы фрагментаваны асадак клетак.

Фрагментаваныя адклады клетак, узятыя, выклічуць калонку ТОЛЬКІ РНК, якая будзе заблакіравана пры выкананні аперацыі адсорбцыі РНК (гл. крок 6).Мы рэкамендуем вам асцярожна адсмоктваць гэты супернатант, каб пазбегнуць адсмоктвання рэшткаў клетак.

3. Пачатковая сума ўзору занадта вялікая.

Празмернае выкарыстанне ўзору прывядзе да няпоўнай фрагментацыі ўзору або няпоўнага лізісу клетак буферам PSL1, што прывядзе да блакіроўкі ачышчальнай калонкі падчас ачысткі.Набор для вылучэння агульнай РНК раслін. Кожны асобны вычышчаны працоўны ўзор складае 50 мг.Для раслінных узораў полиольных поліцукрыдаў мы рэкамендуем вам паспрабаваць Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Тэмпература цэнтрыфугі занадта нізкая.

Увесь працэс вылучэння і ачысткі РНК праводзіцца пры пакаёвай тэмпературы (20-25°C), за выключэннем таго, што тканіна ўзору разбіваецца вадкім азотам. Тэмпература некаторых крыягенных цэнтрыфуг ніжэй за 20℃, што можа выклікаць закаркаванне калонкі для ачысткі ДНК і/або калонкі толькі для РНК.Калі гэта адбылося, усталюйце тэмпературу цэнтрыфугі 20-25℃, іпераканайцеся, што лізісная сумесь і/або супернатант з даданнем этанолу былі папярэдне нагрэтыя да 37°C.

РНК не экстрагаваная або выхад РНК нізкі

Звычайна існуе шмат фактараў, якія ўплываюць на эфектыўнасць аднаўлення, такіх як: змест РНК у пробе, метад працы, аб'ём элюіравання і г.д.

Аналіз агульных прычын, як паказана ніжэй:

1. Падчас аперацыі праводзілі лазню з лёдам або цэнтрыфугаванне пры нізкай тэмпературы (4°C).

Прапанова: працаваць пры пакаёвай тэмпературы (15-25°C) ва ўсім працэсе не рабіце ледзяную ванну і цэнтрыфугаванне пры нізкай тэмпературы.

2. РНК пагаршаецца з-за няправільнага захавання ўзору або доўгатэрміновага захавання ўзору.

Рэкамендацыя: Свежесобранные ўзоры трэба хутка замарозіць у вадкім азоце, а затым захоўваць пры -80°C на працягу доўгага часу, пазбягаць паўторнага замарожвання і адтавання узораў;або неадкладна замачыць узоры ў растворы стабілізатара РНК RNAlater (узоры жывёл).

3. Недастатковая фрагментацыя ўзору і лізіс прыводзяць да закаркаванні ачышчальнай калонкі.

Прапанова: пры драбненні тканіны пераканайцеся, што тканіна дастаткова здробнена, і хутка перанясіце яе ў загадзя падрыхтаваны буфер PSL1 (пераканайцеся, што была дададзена правільная прапорцыя β-ME, гл. крок 1 працэдуры).

4. Элюент быў дададзены няправільна.

Прапанова: пераканайцеся, што ddH2O без РНКазы капае ў сярэдзіну мембраны ачышчальнай калонкі.

5. Правільны аб'ём абсалютнага этанолу не быў дададзены ў буфер PSL2 або буфер PRW2.

Прапанова: выконвайце інструкцыі, дадайце патрэбны аб'ём абсалютнага этанолу ў буфер PSL2 і буфер PRW2 і добра змяшайце перад выкарыстаннем набору.

6. Колькасць узору тканіны недапушчальная.

Прапанова: выкарыстоўвайце 50 мг тканіны на 500 мкл буфера PSL1.Выкарыстанне занадта вялікай колькасці тканін прывядзе да памяншэння колькасці здабываемай РНК, і чысціня атрыманай РНК таксама паменшыцца.Мы настойліва рэкамендуем, каб першапачатковая доза ўзору не перавышала 50 мг на аперацыю экстракцыі РНК.

7.Неадпаведны аб'ём элюіравання або няпоўнае элюіраванне.

Прапанова: аб'ём элюента ачышчальнай калонкі складае 50-200 мкл;калі эфект элюіравання не з'яўляецца здавальняючым, рэкамендуецца падоўжыць час пры пакаёвай тэмпературы пасля дадання папярэдне нагрэтага ddH2O без РНКазы, напрыклад, на 5-10 хвілін.

8. У ачышчальнай калоне ёсць рэшткі этанолу пасля прамывання буферам PRW2.

Прапанова: калі пустая прабірка цэнтрыфугуецца на працягу 1 хвіліны і ў ёй усё яшчэ застаецца этанол пасля прамывання ў буферы PRW2, вы можаце павялічыць час цэнтрыфугавання пустой прабіркі да 2 хвілін або паставіць ачышчальную калонку пры пакаёвай тэмпературы на 5 хвілін, каб цалкам выдаліць рэшткі этанолу.

9. Камплект выкарыстоўваўся няправільна.

Прапанова: для раслінных узораў поліфенольных поліцукрыдаў выкарыстанне звычайных набораў, такіх як Plant Total RNA Isolation Kit, можа не даць магчымасці атрымаць ідэальныя ўзоры РНК.Мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць Plant Total RNA IsolationKit Plus, які спецыяльна распрацаваны для раслінных узораў поліфенольных поліцукрыдаў.Набор, спецыяльна распрацаваны для экстракцыі РНК з узораў поліфенолаў і поліцукрыдаў раслін.

Значэнне OD260/OD280 нізкае

Элюцыя РНК з ddH2O і выкарыстанне для паказанняў на спектрафатометры прыводзіць да нізкіх значэнняў OD260/OD280.Мы рэкамендуем выкарыстоўваць 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 (замест ddH2O без РНКазы для элюіравання РНК), каб атрымаць адносна правільныя значэнні OD260/OD280, гл. «Аналізы канцэнтрацыі і ачысткі РНК» на старонцы 19.

Вычышчаная РНК дэградуе

Якасць вычышчанай РНК звязана з такімі фактарамі, як захаванне ўзору, заражэнне РНКазой і маніпуляцыі.

Аналіз агульных прычын:

1. Узоры тканін не захоўваліся своечасова пасля збору.

Рэкамендацыя: калі ўзоры тканін не былі выкарыстаны своечасова пасля збору, неадкладна захоўвайце іх у вадкім азоце пры нізкай тэмпературы або перанясіце іх пры тэмпературы -80°C для працяглага захоўвання пасля хуткага замарожвання ў вадкім азоце, або неадкладна пагрузіце ўзоры ў раствор стабілізатара РНК RNAlater (узоры жывёл).Для экстракцыі РНК паспрабуйце выкарыстоўваць свежесобранные ўзоры тканін.

2.Паўторнае замарожванне і адтаванне узораў тканін.

Прапанова: пры захоўванні ўзораў тканіны лепш разрэзаць іх на невялікія кавалкі для захавання і выняць частку пры выкарыстанні, каб пазбегнуць дэградацыі РНК, выкліканай шматразовым замарожваннем і адтаваннем узораў.

3. РНКазу ўводзяць у аперацыйнай або не надзяваюць аднаразовыя пальчаткі, маскі і інш.

Прапанова: Эксперыменты па экстракцыі РНК лепш за ўсё праводзіць у асобных аперацыях РНК, а лабараторны стол перад эксперыментам трэба ачысціць, а падчас эксперыменту трэба насіць аднаразовыя пальчаткі і маскі, каб у найбольшай ступені пазбегнуць дэградацыі РНК, выкліканай увядзеннем РНКазы.

4. Рэагент забруджваецца РНКазой падчас выкарыстання.

Прапанова: замяніць на новую серыю набораў для экстракцыі сумарнай РНК раслін для адпаведных эксперыментаў.

5. Цэнтрыфужныя прабіркі і наканечнікі піпетак, якія выкарыстоўваюцца для маніпуляцый РНК, забруджаныя РНКазой.

Прапанова: пераканайцеся, што цэнтрыфужныя прабіркі, наканечнікі піпетак, піпеткі і г.д., якія выкарыстоўваюцца пры экстракцыі РНК, не ўтрымліваюць РНКазы.

Інструкцыі па эксплуатацыі:

Інструкцыя па эксплуатацыі Plant Total RNA Isolation Kit Plus