Няма сігналаў узмацнення

1. ДНК-палімераза Taq у наборы губляе сваю актыўнасць з-за няправільнага захоўвання або заканчэння тэрміну прыдатнасці набору.
Рэкамендацыя: Пацвердзіце ўмовы захоўвання набору;паўторна дадайце адпаведную колькасць ДНК-палімеразы Taq у сістэму ПЦР або купіце новы набор ПЦР у рэальным часе для адпаведных эксперыментаў.

2. У шаблоне ДНК шмат інгібітараў Taq ДНК-палімеразы.
Прапанова: ачысціце шаблон або паменшыце колькасць выкарыстоўванага шаблону.

3. Канцэнтрацыя Mg2+ не падыходзіць.
Рэкамендацыя: канцэнтрацыя Mg2+ у сумесі 2× Real PCR, якую мы прапануем, складае 3,5 мМ.Аднак для некаторых спецыяльных праймераў і шаблонаў канцэнтрацыя Mg2+ можа быць вышэй.Такім чынам, вы можаце непасрэдна дадаць MgCl2 для аптымізацыі канцэнтрацыі Mg2+.Для аптымізацыі рэкамендуецца кожны раз павялічваць Mg2+ на 0,5 ммоль.

4. Умовы ПЦР-ампліфікацыі не падыходзяць, а паслядоўнасць праймера або канцэнтрацыя неналежныя.
Прапанова: пацвердзіце правільнасць паслядоўнасці праймера і праймер не пагаршаецца;калі ўзмацненне сігналу дрэннае, паспрабуйце знізіць тэмпературу адпалу і адпаведным чынам адрэгуляваць канцэнтрацыю грунтоўкі.

5. Колькасць шаблону занадта малая або занадта вялікая.
Рэкамендацыя: выканайце градыентнае развядзенне лінеарызацыі шаблону і абярыце канцэнтрацыю шаблону з найлепшым эфектам ПЦР для эксперыменту ПЦР у рэальным часе.

NTC мае занадта высокае значэнне флуарэсцэнцыі

1. Забруджванне рэагентам падчас працы.
Рэкамендацыя: замяніце на новыя рэагенты для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.

2. Заражэнне адбылося падчас падрыхтоўкі рэакцыйнай сістэмы ПЦР.
Рэкамендацыя: падчас працы прымайце неабходныя меры абароны, такія як: апранайце латексныя пальчаткі, карыстайцеся наканечнікам піпеткі з фільтрам і г.д.

3. Праймеры пагаршаюцца, і дэградацыя праймераў прывядзе да неспецыфічнага ўзмацнення.
Прапанова: выкарыстоўвайце электрафарэз SDS-PAGE, каб вызначыць, ці пагаршаюцца праймеры, і заменіце іх новымі праймерамі для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.

Праймерны дымер або неспецыфічная ампліфікацыя

1. Канцэнтрацыя Mg2+ не падыходзіць.
Рэкамендацыя: канцэнтрацыя Mg2+ у сумесі 2× Real PCR EasyTM Mix, якую мы прапануем, складае 3,5 мм.Аднак для некаторых спецыяльных праймераў і шаблонаў канцэнтрацыя Mg2+ можа быць вышэй.Такім чынам, вы можаце непасрэдна дадаць MgCl2 для аптымізацыі канцэнтрацыі Mg2+.Для аптымізацыі рэкамендуецца кожны раз павялічваць Mg2+ на 0,5 ммоль.

2. Тэмпература ПЦР-адпалу занадта нізкая.
Прапанова: кожны раз павялічвайце тэмпературу ПЦР-адпалу на 1 ℃ або 2 ℃.

3. Прадукт ПЦР занадта доўгі.
Рэкамендацыя: даўжыня прадукту ПЦР у рэальным часе павінна складаць 100-150 біт, не больш за 500 біт.

4. Праймеры пагаршаюцца, і дэградацыя праймераў прывядзе да з'яўлення спецыфічнага ўзмацнення.
Прапанова: выкарыстоўвайце электрафарэз SDS-PAGE, каб вызначыць, ці пагаршаюцца праймеры, і заменіце іх новымі праймерамі для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.

5. Сістэма ПЦР няправільная, або сістэма занадта малая.
Прапанова: занадта малая рэакцыйная сістэма ПЦР прывядзе да зніжэння дакладнасці выяўлення.Лепш за ўсё выкарыстоўваць рэакцыйную сістэму, рэкамендаваную прыборам для колькаснай ПЦР, каб паўторна правесці эксперымент ПЦР у рэальным часе.

Дрэнная паўтаральнасць колькасных значэнняў

1. Прыбор няспраўны.
Прапанова: могуць быць памылкі паміж кожным адтулінай ПЦР прыбора, што прыводзіць да дрэннай узнаўляльнасці падчас рэгулявання тэмпературы або выяўлення.Калі ласка, праверце ў адпаведнасці з інструкцыямі адпаведнага прыбора.

2. Чысціня ўзору не вельмі добрая.
Рэкамендацыя: нячыстыя ўзоры прывядуць да дрэннай узнаўляльнасці эксперыменту, што ўключае ў сябе чысціню шаблону і праймераў.Лепш за ўсё паўторна ачысціць шаблон, а праймеры лепш за ўсё ачысціць SDS-PAGE.

3. Час падрыхтоўкі і захоўвання сістэмы ПЦР занадта вялікі.
Прапанова: выкарыстоўвайце ПЦР-сістэму ў рэальным часе для ПЦР-эксперыменту адразу пасля падрыхтоўкі і не пакідайце яе надоўга.

4. Умовы ПЦР-ампліфікацыі не падыходзяць, а паслядоўнасць праймера або канцэнтрацыя неналежныя.
Прапанова: пацвердзіце правільнасць паслядоўнасці праймера і праймер не пагаршаецца;калі ўзмацненне сігналу дрэннае, паспрабуйце знізіць тэмпературу адпалу і адпаведным чынам адрэгуляваць канцэнтрацыю грунтоўкі.

5. Сістэма ПЦР няправільная, або сістэма занадта малая.
Прапанова: занадта малая рэакцыйная сістэма ПЦР прывядзе да зніжэння дакладнасці выяўлення.Лепш за ўсё выкарыстоўваць рэакцыйную сістэму, рэкамендаваную прыборам для колькаснай ПЦР, каб паўторна правесці эксперымент ПЦР у рэальным часе.