Добра вядома, што ў цэнтральнай догме РНК з'яўляецца пасярэднікам транскрыпцыі паміж ДНК і экспрэсіяй бялку.У параўнанні з выяўленнем ДНК, выяўленне РНК можа больш аб'ектыўна адлюстроўваць экспрэсію генаў у арганізмах.Эксперыменты з удзелам РНК ўключаюць: qRT-PCR, RNA-Seq і выяўленне злітых генаў і г. д. Зыходзячы з характарыстык самой РНК (цукровае кальцо РНК мае на адну свабодную гідраксільную групу больш, чым цукровае кольца ДНК), у спалучэнні з вялікай колькасцю РНКаз у навакольным асяроддзі, РНК больш нестабільная і лягчэй паддаецца дэградацыі, чым ДНК.Калі якасць РНК дрэнная, то вынікі эксперыменту павінны быць нездавальняючымі, у прыватнасці, выяўляцца ў недакладных дадзеных або дрэннай паўтаральнасці.Такім чынам, больш увагі трэба надаваць апрацоўцы РНК, і звяно кантролю якасці таксама больш важна для забеспячэння дакладнасці і дакладнасці наступных эксперыментальных дадзеных.

Для кантролю якасці РНК звычайна выкарыстоўваюцца наступныя метады:

• Спектрафатаметрыя
• электрафарэз у агарозном гелі
• Біяаналізатар Agilent
• флуоресцентная колькасная ПЦР у рэжыме рэальнага часу
• Метад флуоресцентного фарбавальніка Qubit

01 Спектрафатаметрыя

РНК мае кан'югаваныя падвойныя сувязі і мае пік паглынання на даўжыні хвалі 260 нм.Згодна з законам Ламберта-Бера, мы можам вылічыць канцэнтрацыю РНК па піку паглынання пры 260 нм.Акрамя таго, мы таксама можам разлічыць чысціню РНК у адпаведнасці з суадносінамі пікаў паглынання 260 нм, 280 нм і 230 нм.280 нм і 230 нм - гэта пікі паглынання бялкоў і малых малекул адпаведна.Суадносіны A260/A280 і A260/A230 кваліфікаванай чысціні РНК павінны быць больш за 2. Калі яно менш за 2, гэта азначае, што ва ўзоры РНК прысутнічае забруджванне бялком або невялікімі малекуламі, і яго трэба зноў ачысціць.Крыніцы забруджвання будуць уплываць на далейшыя эксперыменты, напрыклад, падаўляць эфектыўнасць ампліфікацыі рэакцый ПЦР, што прывядзе да недакладных колькасных вынікаў.Чысціня РНК мае вялікі ўплыў на наступныя вынікі, таму спектрафатаметрыя звычайна з'яўляецца незаменным звяном кантролю якасці на першым этапе эксперыментаў з нуклеінавымі кіслотамі.

Малюнак 1. Тыповы спектр паглынання РНК/ДНК

02 Электрафарэз у агарозным гелі

Акрамя чысціні, цэласнасць РНК таксама з'яўляецца адным з важных паказчыкаў для ацэнкі якасці РНК.Дэградацыя РНК прывядзе да вялікай колькасці кароткіх фрагментаў ва ўзоры, таму колькасць фрагментаў РНК, якія можна эфектыўна выявіць і пакрыць эталоннай паслядоўнасцю, будзе зменшана.Цэласнасць РНК можна праверыць з дапамогай электрафарэзу агульнай РНК на 1% агарозном гелі.Гэты метад можа наладзіць гель самастойна або выкарыстоўваць зборную сістэму E-Gel™ для праверкі цэласнасці.Больш за 80% агульнай РНК складае рыбасомная РНК, большасць з якіх складаецца з 28S і 18S рРНК (у сістэмах млекакормячых).РНК добрай якасці будзе паказваць дзве відавочныя яркія паласы, якія з'яўляюцца яркімі палосамі 28S і 18S адпаведна, на 5 Кб і 2 Кб, і суадносіны будуць блізкія да 2:1.Калі ён знаходзіцца ў дыфузным стане, гэта азначае, што ўзор РНК мог быць дэградаваны, і рэкамендуецца выкарыстоўваць метад, апісаны пазней, для далейшага тэставання якасці РНК.

Малюнак 2. Параўнанне дэградаванай (дарожка 2) і непашкоджанай РНК (дарожка 3) пры электрафарэзе ў агарозным гелі

03 Біяаналізатар Agilent

У дадатак да апісанага вышэй метаду электрафарэзу ў агарозным гелі, які можа дапамагчы нам проста і хутка вызначыць цэласнасць РНК, мы таксама можам выкарыстоўваць біяаналізатар Agilent для вызначэння цэласнасці РНК.Ён выкарыстоўвае камбінацыю мікрафлюідыкі, капілярнага электрафарэзу і флюарэсцэнцыі для ацэнкі канцэнтрацыі і цэласнасці РНК.Выкарыстоўваючы ўбудаваны алгарытм для аналізу профілю ўзору РНК, біяаналізатар Agilent можа вылічыць эталоннае значэнне цэласнасці РНК, нумар цэласнасці РНК (далей RIN) [1].Чым большае значэнне RIN, тым вышэйшая цэласнасць РНК (1 - надзвычай пагаршаная, 10 - найбольш поўная).Некаторыя эксперыменты з удзелам РНК прапануюць выкарыстоўваць RIN як параметр для ацэнкі якасці.Прымаючы ў якасці прыкладу эксперыменты з высокапрадукцыйным секвенированием (далей NGS), рэкамендацыі Oncomine™ Human Immune Repertoire, якія выкарыстоўваюцца для выяўлення антыгенных рэцэптараў В-клетак і Т-клетак у серыі панэляў Thermo Fisher Oncomine, мяркуюць, што ўзоры са значэннямі RIN больш за 4 можна вымераць больш эфектыўныя счытванні і клоны (малюнак 3).Існуюць розныя рэкамендаваныя дыяпазоны для розных панэляў, і часта больш высокі RIN можа прынесці больш эфектыўныя дадзеныя.

На малюнку 3 у эксперыментах па імунным рэпертуары чалавека Oncomine™ узоры з RIN больш за 4 могуць выяўляць больш эфектыўныя паказанні і клоны Т-клетак.【2】

Аднак значэнне RIN таксама мае некаторыя абмежаванні.Хоць RIN мае высокую карэляцыю з якасцю эксперыментальных даных NGS, ён не падыходзіць для ўзораў FFPE.Узоры FFPE падвяргаліся хімічнай апрацоўцы на працягу доўгага часу, і экстрагаваная РНК звычайна мае адносна нізкае значэнне RIN.Аднак гэта не азначае, што эфектыўныя дадзеныя эксперыменту павінны быць нездавальняючымі.Каб дакладна ацаніць якасць узораў FFPE, нам трэба выкарыстоўваць іншыя вымярэнні, акрамя RIN.У дадатак да RIN біяаналізатар Agilent таксама можа разлічваць значэнне DV200 як параметр ацэнкі якасці РНК.DV200 - гэта параметр, які разлічвае долю фрагментаў памерам больш за 200 пн ва ўзоры РНК.DV200 з'яўляецца лепшым паказчыкам якасці ўзору FFPE, чым RIN.Для РНК, экстрагаванай FFPE, яна мае вельмі высокую карэляцыю з колькасцю генаў, якія могуць быць эфектыўна выяўлены, і разнастайнасцю генаў [3].Хаця DV200 можа кампенсаваць недахопы ў якасным выяўленні FFPE, біяаналізатар Agilent па-ранейшаму не можа ўсебакова прааналізаваць праблемы якасці ва ўзорах РНК, у тым ліку наяўнасць інгібітараў ва ўзорах.Самі інгібітары могуць уплываць на эфектыўнасць узмацнення эксперыментаў і памяншаць колькасць карысных даных.Каб даведацца, ці ёсць інгібітар ва ўзоры, мы можам прыняць метад колькаснай флуоресцентной ПЦР у рэальным часе, апісаны далей.

04 флуоресцентная колькасная ПЦР у рэжыме рэальнага часу

Флуарэсцэнтны колькасны метад ПЦР у рэжыме рэальнага часу можа не толькі выявіць інгібітары ва ўзоры, але і дакладна адлюстраваць якасць РНК ва ўзоры FFPE.У параўнанні з біялагічнымі аналізатарамі Agilent колькасныя прыборы флуарэсцэнцыі ў рэжыме рэальнага часу больш папулярныя ў буйных біялагічных лабараторыях з-за іх больш шырокага прымянення.Каб праверыць якасць узораў РНК, нам трэба толькі набыць або падрыхтаваць праймерныя зонды для ўнутраных эталонных генаў, такіх як GUSB (номер па каталогу Hs00939627).Выкарыстоўваючы гэты набор праймераў, зондаў і стандартаў (агульная РНК вядомай канцэнтрацыі) для правядзення абсалютных колькасных эксперыментаў, эфектыўная канцэнтрацыя фрагмента РНК можа быць разлічана як стандарт ацэнкі якасці РНК (скарочана функцыянальнае колькаснае вызначэнне РНК (FRQ).У тэсце NGS мы выявілі, што FRQ узораў РНК мае вельмі высокую карэляцыю з эфектыўным аб'ёмам даных.Для ўсіх узораў, якія перавышаюць 0,2 нг/мкл FRQ, па меншай меры 70% паказанняў могуць эфектыўна ахопліваць эталонную паслядоўнасць (малюнак 4).

На малюнку 4 значэнне FRQ, выяўленае колькасным метадам флуарэсцэнцыі, мае вельмі высокую карэляцыю (R2>0,9) з эфектыўнымі дадзенымі, атрыманымі ў эксперыменце NGS.Чырвоная лінія - гэта значэнне FRQ, роўнае 0,2 НГ/мкл (log10 = -0,7).【4】

У дадатак да прымянення да ўзораў FFPE, метад колькаснай ПЦР у рэжыме рэальнага часу можа таксама эфектыўна кантраляваць інгібітары ў пробах.Мы можам дадаць узор, які трэба выявіць, у рэакцыйную сістэму з дапамогай унутранага станоўчага кантролю (IPC) і яго аналізу, а затым выканаць колькаснае вызначэнне флуарэсцэнцыі, каб атрымаць значэнне Ct.Калі значэнне Ct адстае ад значэння Ct у рэакцыі без пробы, гэта сведчыць аб тым, што інгібітар прысутнічае ва ўзоры і тармозіць эфектыўнасць узмацнення ў рэакцыі.

05 Метад флуоресцентного фарбавальніка Qubit

Флюорометр Qubit - гэта найбольш часта выкарыстоўваная невялікая прылада для вызначэння канцэнтрацыі і чысціні нуклеінавых кіслот, якая простая ў эксплуатацыі і існуе амаль у кожнай лабараторыі малекулярнай біялогіі.Ён дакладна разлічвае канцэнтрацыю нуклеінавай кіслаты шляхам выяўлення і звязвання нуклеінавай кіслаты флуарэсцэнтнага фарбавальніка (рэагент для выяўлення Qubit).Qubit валодае высокай адчувальнасцю і спецыфічнасцю і можа дакладна колькасна вызначаць РНК да канцэнтрацыі пг/мкл.У дадатак да добра вядомай здольнасці дакладна колькасна вызначаць канцэнтрацыю нуклеінавых кіслот, апошняя новая мадэль Thermo Fisher, Qubit 4.0, таксама можа выяўляць цэласнасць РНК.Сістэма выяўлення РНК Qubit 4.0 (аналіз RNA IQ) выяўляе цэласнасць РНК шляхам адначасовага выяўлення двух спецыфічных флуарэсцэнтных фарбавальнікаў.Гэтыя два флуарэсцэнтныя фарбавальнікі могуць звязвацца з вялікімі і малымі фрагментамі РНК адпаведна.Гэтыя два флуарэсцэнтныя фарбавальнікі паказваюць долю вялікіх фрагментаў РНК ва ўзоры, і з гэтага можна вылічыць значэнне IQ (цэласнасці і якасці), якое адлюстроўвае якасць РНК.Значэнне IQ прымяняецца як да ўзораў FFPE, так і да ўзораў без FFPE і мае вялікі ўплыў на якасць наступнай паслядоўнасці.Беручы ў якасці прыкладу эксперыменты NGS, у тэставых эксперыментах RNA-Seq, праведзеных на платформе Ion torrent™, большасць узораў са значэннямі IQ больш за 4 мелі па меншай меры 50% эфектыўных паказанняў (малюнак 5).У параўнанні з вышэйзгаданымі метадамі выяўлення Qubit IQ Assay не толькі больш зручны ў выкарыстанні і займае менш часу (на працягу пяці хвілін), але таксама мае вялікую карэляцыю паміж вымераным значэннем параметра IQ і якасцю даных далейшых эксперыментаў.

На малюнку 5 існуе значная карэляцыя паміж значэннем Qubit RNA IQ і адлюстраванымі паказаннямі RNA-Seq.【5】

Дзякуючы прыведзеным вышэй уводзінам, я лічу, што кожны мае дастатковае разуменне розных метадаў кантролю якасці РНК.На практыцы можна выбірацьадпаведны метад у залежнасці ад тыпу ўзору і існуючых інструментаў.Толькі добра кантралюючы якасць РНК, мы можам пазбегнуць няўдач наступных эксперыментаў, выкліканых нізкай якасцю ўзору, зэканоміўшы такім чынам каштоўны час, энергію і грошы.

Даведачныя прадукты:

Набор для вылучэння агульнай РНК жывёл

Набор для вылучэння агульнай РНК клетак

спасылкі

【1】Шродэр, А., Мюлер, О., Стокер, С. і інш.RIN: нумар цэласнасці РНК для прысваення значэнняў цэласнасці вымярэнням РНК.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Кіраўніцтва карыстальніка Oncomine Human Immune Repertoire (публікацыя № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived from Archival Fixed-Parafin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, том 170, выпуск 2, жнівень 2019 г., старонкі 357 –373,https://doi.org/10.1093/toxsci/