Мы былі вопытным вытворцам.Заваяванне большасці ў найважнейшых сертыфікатах на сваім рынку для Кітайскага высокаадчувальнага аднакрокавага зонда з вялікімі зніжкамі Rt-QpcrКамплект V2, Якасць - гэта жыццё завода, Арыентацыя на попыт кліента - крыніца выжывання і развіцця кампаніі, Мы прытрымліваемся сумленнасці і добрасумленнасці ў працы, з нецярпеннем чакаем вашага прыходу!
Мы былі вопытным вытворцам.Заваяванне большасці ў важных сертыфікатах на сваім рынкуChina Taq ДНК-палімераза, Qpcr, Наша кампанія абяцае: разумныя цэны, кароткі час вытворчасці і здавальняючае пасляпродажнае абслугоўванне, мы таксама запрашаем вас наведаць наш завод у любы час.Жадаю, каб у нас быў прыемны і доўгі час разам!!!

Апісанні

У гэтым наборы выкарыстоўваецца унікальная буферная сістэма для лізісу, якая можа хутка вызваляць РНК з культывуемых узораў клетак для рэакцый RT-qPCR, тым самым ухіляючы працаёмкі і працаёмкі працэс ачысткі РНК.Шаблон РНК можна атрымаць усяго за 7 хвілін.Рэагенты 5×Direct RT Mix і 2×Direct qPCR Mix-SYBR, якія ўваходзяць у камплект, дазваляюць хутка і эфектыўна атрымліваць колькасныя вынікі ПЦР у рэальным часе.

5×Direct RT Mix і 2×Direct qPCR Mix-SYBR маюць моцную талерантнасць да інгібітараў, і лізат узораў можна выкарыстоўваць у якасці шаблону непасрэдна для RT-qPCR.Гэты набор змяшчае унікальную высокаафінную зваротную транскрыптазу Foregene з РНК і ДНК-палімеразу Hot D-Taq, dNTP, MgCl₂, рэакцыйны буфер, ПЦР-аптымізатар і стабілізатар.

Тэхнічныя характарыстыкі

200 × 20 мкл Rxns, 1000 × 20 мкл Rxns

Складнікі камплекта

Асаблівасці і перавагі

■ Проста і эфектыўна: з дапамогай тэхналогіі Cell Direct RT ўзоры РНК можна атрымаць усяго за 7 хвілін.

■ Попыт на выбарку невялікі, можна праверыць усяго 10 клетак.

■ Высокая прапускная здольнасць: ён можа хутка выяўляць РНК у клетках, культывуемых у 384, 96, 24, 12, 6-лункавых пласцінах.

■ DNA Eraser можа хутка выдаліць вызваленыя геномы, значна паменшыць уплыў на наступныя эксперыментальныя вынікі.

■ Аптымізаваная сістэма RT і qPCR робіць двухэтапную зваротную транскрыпцыю RT-PCR больш эфектыўнай, а ПЦР больш спецыфічнай і больш устойлівай да інгібітараў рэакцыі RT-PCR.

Прыкладанне камплекта

Сфера прымянення: культываванне клетак.

- РНК, вызваленая ў выніку лізісу ўзору: прымяняецца толькі да шаблону RT-qPCR гэтага набору.

- Набор можа быць выкарыстаны для наступных мэт: аналіз экспрэсіі генаў, праверка апасродкаванага siRNA эфекту сайленсінгу генаў, скрынінг лекаў і г.д.

Дыяграма

Захоўванне і тэрмін прыдатнасці

Частка I гэтага набору павінна захоўвацца пры тэмпературы 4 ℃;Частка II павінна захоўвацца пры -20 ℃.

Foregene Protease Plus II варта захоўваць пры тэмпературы 4 ℃, не замарожваць пры -20 ℃.

Рэагент 2×Direct qPCR Mix-SYBR трэба захоўваць пры -20 ℃ у цемры;пры частым выкарыстанні яго таксама можна захоўваць пры тэмпературы 4 ℃ для кароткачасовага захоўвання (выкарыстоўваць на працягу 10 дзён). Мы з'яўляемся вопытным вытворцам.Заваяванне большасці ў найважнейшых сертыфікатах на сваім рынку па вялікіх скідках, Кітай, высокаадчувальны аднакрокавы зонд Rt-Qpcr Kit V2, Якасць - гэта жыццё завода, Засяроджанасць на попытах кліентаў - крыніца выжывання і развіцця кампаніі, Мы прытрымліваемся прынцыпаў сумленнасці і добрасумленнасці ў працы, з нецярпеннем чакаем вашага прыходу!
Вялікія зніжкіChina Taq ДНК-палімераза, Qpcr, Наша кампанія абяцае: разумныя цэны, кароткі час вытворчасці і здавальняючае пасляпродажнае абслугоўванне, мы таксама запрашаем вас наведаць наш завод у любы час.Жадаю, каб у нас быў прыемны і доўгі час разам!!!

QuickEасыTM Cell Direct RT-qПЦР Kit -Такмan

Кат.No.DRT-01021/01022

Для клетачнай прамой RT-qPCR з выкарыстаннем ≤ 1000 000 клетак

Увядзенне прадукту

У гэтым прадукце выкарыстоўваецца унікальная буферная сістэма лізісу для хуткага вызвалення РНК з узораў культывуемых клетак для рэакцый RT-qPCR, ухіляючы працаёмкі і працаёмкі працэс ачысткі РНК і ўсяго 7 хвілін, каб атрымаць неабходны шаблон РНК, з дапамогай 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, якія ўваходзяць у камплект, можа хутка і эфектыўна атрымаць колькасныя вынікі ПЦР у рэальным часе.

5× Direct RT Mix і 2× Direct qPCR Mix-Taqman маюць моцную талерантнасць да інгібітараў і могуць выконваць эфектыўную рэверсію і спецыфічную ампліфікацыю з выкарыстаннем лізата ўзору для вымярэння ў якасці шаблону.Рэагент змяшчае зваротную транскрыптазу Foregene, ДНК-палімеразу Hot D-Taq, dNTPs, MgCl₂, буфер рэакцыі, аптымізатар і стабілізатар ПЦР, які можа выкарыстоўвацца з буферам лізісу для хуткага і лёгкага выяўлення ўзораў і мае характарыстыкі высокай адчувальнасці, спецыфічнасці і стабільнасці.

Асаблівасці прадукту

Простая, эфектыўная тэхналогія Cell Direct RT, якая займае ўсяго 7 хвілін, каб атрымаць узор РНК.

Патрабаванні да ўзораў невялікія, і для эксперыментаў можна выкарыстоўваць як мінімум 10 культывуемых клетак.

Высокая прадукцыйнасць для хуткага атрымання РНК культывуемых клетак, такіх як 384, 96, 24, 12 і 6-лункавыя пласціны.

DNA Eraser здольны хутка выдаляць вызваленыя геномы, значна зніжаючы ўплыў на наступныя вынікі эксперыментаў.

Аптымізаваныя сістэмы RT і qPCR забяспечваюць двухэтапную RT-PCR з больш эфектыўнай зваротнай транскрыпцыяй, спецыфічнасцю і больш моцнай талерантнасцю да інгібітараў рэакцыі RT-qPCR.

Прыкладанне камплекта

Сфера прымянення: культывуюцца клеткі.

РНК, інтэрпрэтаваная лізісам узору: выкарыстоўваецца толькі ў якасці двухэтапнай матрицы RT-qPCR.

Наборы могуць быць выкарыстаны для наступных мэт: аналіз рэгулятарнай экспрэсіі генаў, тэставанне алеляў, скрынінг лекаў і г.д.

Абмежаванні камплекта

Ампліфікаваныя фрагменты ≤ 300 пн.

Наборы выкарыстоўваюцца для свежай культуры клетак.

Кантроль якасці прадукцыі

Згодна з агульнай сістэмай менеджменту якасці FOREGENE, кожная партыя набораў серыі Cell Direct RT-qPCR праходзіць некалькі строгіх выпрабаванняў, каб гарантаваць надзейнасць і стабільнасць якасці кожнай партыі набораў.

Змест камплекта

*:Лізіс клетак, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman можна набыць асобна, падрабязная інфармацыя прыведзена ў Дадатку 1 (СТАР. 13).

Умовы захоўвання

1. Умовы дастаўкі

Увесь працэс транспарціроўкі пакета з лёдам пры нізкай тэмпературы, каб гарантаваць, што камплект знаходзіцца ў стане <4 °C.

2. Умовы захоўвання

Частку I захоўваць пры тэмпературы 4°C, а частку II - пры -20°C.

Foregene Protease Plus II варта захоўваць пры тэмпературы 4°C, не замарожваць пры -20°C.

Рэагент 2× Direct qPCR Mix-Taqman захоўваецца пры -20°C або пры 4°C для кароткачасовага выкарыстання пры частым выкарыстанні (на працягу 10 дзён).

Інфармацыя аб кампанентах камплекта

Буфер CL: забяспечвае асяроддзе, неабходнае для рэакцый лізісу клетак.

Буфер ST: спыняе актыўнае рэчыва ў лізаце, каб пазбегнуць уплыву на наступную RT.

DNA Eraser: сродак для выдалення ДНК, уплыў выдалення геному на наступныя эксперыменты.

5× Direct RT Mix: утрымлівае зваротную транскрыптазу Foregene з высокім сродствам да РНК, інгібітар РНКазы, dNTP, стабілізатары, энхансеры, аптымізатары і праймеры зваротнай транскрыпцыі для аптымальнага выраўноўвання (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Буквар).

Foregene Protease Plus II: У кантэксце буфера для лізісу клеткі лізіруюцца для вызвалення нуклеінавых кіслот.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: гэты рэагент утрымлівае гарачую ДНК-палімеразу D-Taq, dNTP, MgCl₂, буфер рэакцыі, аптымізатар ПЦР і стабілізатар.

20× ROX Reference Dye: звычайна выкарыстоўваецца на прыборах для ПЦР-ампліфікацыі ў рэжыме рэальнага часу ABI, Stratagene і іншых кампаній, ён выкарыстоўваецца для рэгулявання розніцы паміж прабіркамі для ПЦР і прабіркамі, выкліканымі памылкамі дазавання ПЦР.Канцэнтрацыя эталоннага фарбавальніка 20× ROX, неабходная для розных прыбораў, адрозніваецца, і карыстальнік можа дадаць яе ў адпаведнасці з рэкамендаванай канцэнтрацыяй прыбора.

ddH без РНКазы₂O: стэрылізаваная звышчыстая вада без РНКаз для двухэтапнай рэакцыі RT-qPCR.

Меры засцярогі:(Перад выкарыстаннем набору ўважліва прачытайце меры засцярогі)

Звярніце ўвагу на метад правядзення эксперыменту, каб пазбегнуць перакрыжаванага заражэння паміж узорамі.

Звярніце ўвагу на чысціню эксперыментальнага асяроддзя і посуду, каб пазбегнуць заражэння РНКазой і дэградацыі РНК.

Бяры свежыя або добра захаваныя ўзоры клетак і ніколі не выкарыстоўвай паўторна замарожаныя-размарожаныя ўзоры клетак.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman павінен пазбягаць паўторнага замарожвання-адтавання, інакш гэта паўплывае на зваротную транскрыпцыю і эфектыўнасць ПЦР.

падрыхтоўкапайкіранейаперацыя

Не забудзьцеся ўважліва прачытаць інструкцыю перад выкарыстаннем гэтага набору.Набор Cell Direct RT-qPCR просты, зручны і хуткі ў выкарыстанні, а інструкцыя дае поўную інфармацыю пра ўвесь набор і пра тое, як ім правільна карыстацца.Перад выкарыстаннем падрыхтуйце неабходныя эксперыментальныя матэрыялы і абсталяванне.

Эксперыментальныя матэрыялы і абсталяванне

◆ Культура клетак.

◆ 1,5 мл або 2 мл, цэнтрыфужная прабірка без РНКазы/ДНКазы, наканечнік без РНКазы/ДНКазы, стэрыльная прабірка qPCR 0,2 мл.

◆ Апарат кПЦР, піпетка, настольная цэнтрыфуга (≥13 400×ж) (у залежнасці ад эксперыментальных патрэб) і інш.

Бяспека

◆ Гэты прадукт прызначаны толькі для навукова-даследчых мэтаў, калі ласка, не выкарыстоўвайце яго ў фармацэўтычных, клінічных, харчовых і касметычных мэтах.

◆ Пры выкарыстанні хімічных рэчываў апранайце адпаведнае лабараторнае адзенне, пальчаткі, ахоўныя акуляры і г.д.

Аперацыягіды

Сістэмы Cell Lysis, сістэмы RT і пакеты дадатковых раствораў для рэакцыі кПЦР можна набыць асобна, падрабязнасці ў Дадатку 1 (СТАР. 13).

Кіраўніцтва па эксплуатацыі

A: Узор вызвалення РНК

1. Клеткі былі папярэдне апрацаваны: прамыйце пласціну з культурай клетак халодным PBS, затым лізіруйце клеткі (10-10⁶), 10⁶ чым колькасць клетак, рэкамендуецца Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) або Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) для экстракцыі і ачысткі РНК.

1.1.Адгезійныя клеткі (у якасці прыкладу пласціна з 24 лункамі)

1.1.1.Вызначце колькасць клетак у кожнай лунцы, вызначыце, што колькасць клетак роўна 1 × 10⁵, і выкарыстоўвайце піпетку, каб выдаліць пажыўнае асяроддзе з культуральнага посуду.

1.1.2.Дадайце 200 мкл папярэдне астуджанага 1 × PBS у кожную лунку.Не піпетуйце паўторна і выдаляйце PBS з лунак.Нахіліце талерку і выдаліце ​​як мага больш PBS.Перайдзіце да кроку 2.

1.1.3.Для прамывання клетак у чашку для культывавання клетак дабаўлялі папярэдне астуджаны 1 × PBS у іншую чашку для культывавання клетак або табліцу даведачнага нумара 1-1.

Табліца 1-1: дазавання PBS для рознай колькасці клетак

Нататка:Каб забяспечыць цвёрдую клетку，вялікая колькасць страт клетак пазбегнуць пры мыцці.

1.2.Суспензійныя клеткі або адгезійныя клеткі культывуюцца ў непарыстых пласцінах

1.2.1.Адгезійныя клеткі, культываваныя ў нешматлункавых пласцінах (суспензійныя клеткі пачынаюць з наступнага кроку 1.2.2), збіраюць і аддзяляюць клеткі ў адпаведнасці са звычайным метадам збору клетак і змяшчаюць іх у культуральную пласціну або цэнтрыфужную прабірку;калі выкарыстоўваецца трыпсінізацыя, патрабуецца цэнтрыфугаванне для збору клетак і выдалення рэшткаў трыпсінаў, дададзены PBS, ресуспендированный клеткі ў асобныя клеткі, каб развеяць клеткі.

1.2.2.Пасля падліку колькасці клетак разбярыце аліквоты клетак 1×10⁵ адну ў прабіркі для цэнтрыфугі, збярыце клеткі цэнтрыфугаваннем пры 1000 × g на працягу 10 хвілін.

1.2.3.Дадайце 200 мкл PBS у цэнтрыфужную прабірку, не піпетуйце паўторна, а прама аспіруйце PBS.перайдзіце да кроку 2. (Калі цяжка асадзіцца і клеткі былі ресуспендированы зноў, можа быць выканана 1000×g цэнтрыфугаванне праз 10 хвілін пасля адкідвання супернатанта, асадак клетак перайдзіце да этапу 2)

2. Лізіс клетак: выдаліце ​​​​буфер CL, яго тэмпературу ўраўнаважыць да пакаёвай тэмпературы, гумку ДНК і пратэазу Foregene Plus II у адпаведнасці з наступнай табліцай 1-2, падрыхтаваную сістэму для лізісу: (Раствор для лізісу гатовы да выкарыстання).

Табліца1-2: расшчапленне сістэмная падрыхтоўка (Заўвага: пры падрыхтоўцы на лёдзе)

3. (у якасці прыкладу пласціна з 24 лункамі) Унясіце 200 мкл асноўнай сумесі для лізісу клетак у кожную лунку, паўторна прадзімайце 5-10 разоў, інкубуйце пры пакаёвай тэмпературы (20-25 ℃) на працягу 5 хвілін.

Нататка:Каб пазбегнуць утварэння бурбалак, калі ласка, пры піпетцы маштаб піпеткі быў адрэгуляваны на 200 мкл або менш.Клеткі могуць выглядаць мутнымі пасля лізісу, што нармальна.

4. (24-лункавы плашч у якасці прыкладу) дадаюць у вадкасць 20 мкл буфера ST (розныя сістэмы лізісу буфер ST дадаюць у колькасці, паказаным у табліцы 1-3), паўторнае піпетаванне 5-10 разоў пры пакаёвай тэмпературы (20-25 ℃) інкубуюць на працягу 2 хвілін.

Нататка:Наканечнік піпеткі знаходзіцца пад паверхняй, забяспечваючы даданне лізата，каб пазбегнуць адукацыі бурбалак, калі ласка, пры піпетцы шкала піпеткі была адрэгулявана на 200 мкл або менш.

Табліца 1-3:Дадаць буфер ST

5. Лізат выкарыстоўваецца для наступных эксперыментаў RT-qPCR.Калі наступныя эксперыменты не могуць быць выкананы своечасова, захоўвайце яго на лёдзе не больш за 2 гадзіны і захоўвайце пры -20 ℃ або -80 ℃ (не больш за тры месяцы).

B: падрыхтоўка сістэмы RT

1. Дастаньце 5 × Direct RT Mix і пастаўце на ледзяную ванну, дайце ёй расплавіцца натуральным шляхам і асцярожна змяшайце для наступнага выкарыстання;дастаньце ddH2O без РНКазы, растапіце яго і пастаўце на ледзяную ванну для наступнага выкарыстання.Падрыхтуйце рэакцыйную сістэму на лёдзе ў адпаведнасці з табліцай 2-1 ніжэй.

Табліца 2-1: Падрыхтоўка рэакцыйнай сістэмы RT

2.Пасля завяршэння падрыхтоўкі сістэмы асцярожна змяшайце і ненадоўга адцэнтрыфугуйце ў наступнай табліцы 2 -2 умоў рэакцыі Рэакцыя RT.

Табліца 2-2: Налада ўмоў рэакцыі RT

3.Пасля завяршэння рэакцыі прадукт рэакцыі быў змешчаны непасрэдна на лёд для правядзення кПЦР, калі ласка, пастаўце яго ў доўгатэрміновае захаванне -20 ℃ або -80 ℃.

Заўвага: з-за выкарыстання неачышчанага шаблону ў прадукце зваротнай транскрыпцыі могуць з'явіцца белыя ападкі.Гэта нармальная з'ява.Неадкладна адцэнтрыфугуйце супернатант для наступных эксперыментаў.

Атрыманы рэакцыйны раствор для RT дадаецца ў наступныя рэакцыйныя сістэмы ПЦР у рэжыме рэальнага часу, рэкамендуецца дадаваць колькасць ад 10-30% рэакцыйнай сістэмы.

C: падрыхтоўка рэакцыйнай сістэмы кПЦР

1. Адпаведная колькасць B, прыгатаваная ў стадыі шаблону кДНК у адпаведнасці з наступнай табліцай 3-1, для падрыхтоўкі рэакцыйнай сістэмы.

Заўвага: Колькасць шаблону кДНК складае 10-30% сістэмы кПЦР.Напрыклад, у сістэму qPCR аб'ёмам 20 мкл дадайце 2-6 мкл буфера для лізісу, але не больш за 6 мкл.

2. Аптымізацыя добрых умоў qPCR (тэмпература адпалу і г.д.) для рэакцыі qPCR (умовы рэакцыі прыведзены ў табліцы 3-2).

Заўвага: паспрабуйце выкарыстоўваць аптымізаваныя ўмовы для рэакцыі кПЦР, каб атрымаць лепшыя вынікі.

Табліца 3-1: Падрыхтоўка рэакцыйнай сістэмы ПЦР

1*: Канцэнтрацыю праймера можна рэгуляваць у дыяпазоне 50-900 нМ, калі рэакцыя праймера дрэнная.

Заўвага: сістэму qPCR можна наладзіць у адпаведнасці з эксперыментальнымі патрэбамі і мадэллю флуарэсцэнтнага цыклю.Для кПЦР у 50μl сістэмы, адрэгулюйце дазоўку рэагента прапарцыйна ў адпаведнасці з 20μл сістэма.

2*: Выберыце адпаведную канчатковую канцэнтрацыю эталоннага фарбавальніка ROX у адпаведнасці з колькасным тэрмацыклерам флуарэсцэнцыі.Найбольш прыдатныя канцэнтрацыі эталоннага фарбавальніка ROX для звычайных колькасных цыклаў флуарэсцэнцыі паказаны ў табліцы ніжэй:

Табліца 3-2: прадстаўлены ўмовы рэакцыі кПЦР

Заўвага: каб атрымаць найлепшы эфект кПЦР, можна выкарыстоўваць градыентную ПЦР для аптымізацыі ўмоў рэакцыі для розных шаблонаў і розных праймераў.Умовы рэакцыі ПЦР вар'іруюцца ў залежнасці ад аналізатара флуарэсцэнцыі, шаблону, праймера і г. д. У канкрэтнай аперацыі неабходна распрацаваць аптымальныя ўмовы рэакцыі ў адпаведнасці са спецыфічнымі ўмовамі колькаснага термоциклера флуарэсцэнцыі, тыпам шаблону, памерам цікавага фрагмента, паслядоўнасцю асноў ампліфікаванага фрагмента і ўтрыманнем GC і даўжынёй праймераў, уключаючы тэмпературу адпалу, час рэакцыі і г.д.

Прынцыпы распрацоўкі праймераў ПЦР у рэальным часе

Пярэдні буквар і адваротны буквар

Для ПЦР у рэжыме рэальнага часу дызайн праймера вельмі важны.Праймеры звязаны са спецыфічнасцю і эфектыўнасцю ПЦР-ампліфікацыі і могуць быць распрацаваны з улікам наступных прынцыпаў:

◆ Даўжыня грунтоўкі: 18-30 п.н.

◆ Змест GC: 40-60%.

◆ Значэнне Tm: праграмнае забеспячэнне для распрацоўкі Primer 5 можа даць значэнне Tm для праймера.Значэнні Tm праймераў вышэй і ніжэй па плыні павінны быць як мага больш блізкімі.Таксама можна выкарыстоўваць формулу разліку Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Пры правядзенні ПЦР у якасці тэмпературы адпалу звычайна выбіраецца тэмпература ніжэйшая за значэнне Tm праймера на 5 °C (адпаведнае павелічэнне тэмпературы адпалу можа павялічыць спецыфічнасць рэакцыі ПЦР).

◆ Праймеры і прадукты ПЦР:

◆ Даўжыня прадукту ПЦР-ампліфікацыі праймера пераважна складае 100-150 п.н.

◆ Наколькі гэта магчыма, варта пазбягаць дызайнерскіх грунтовак у другаснай структурнай вобласці шаблону.

◆ Пазбягайце ўтварэння 2 ці больш камплементарных асноў паміж 3'-канцамі праймераў вышэй і ніжэй па плыні.

◆ Канцавая аснова праймера 3' не можа прысутнічаць з 3 дадатковымі паслядоўнымі G або C.

◆ Праймеры самі па сабе не могуць мець дадатковыя структуры, у адваротным выпадку будзе ўтворана шпількавая структура, якая паўплывае на ПЦР-ампліфікацыю.

◆ ATCG павінен быць размеркаваны як мага раўнамерней у паслядоўнасці праймера, і варта пазбягаць 3' канцавога падставы, паколькі T.

дадатак1:Cell DirectRT-кПЦР Камплект камплектат дадатак пакет

1. Раствор для лізісу клетак