Эксперымент RT-qPCR уключае экстракцыю РНК і ацэнку якасці, зваротную транскрыпцыю і qPCR у тры этапы, кожны этап мае мноства мер засцярогі, якія мы падрабязна азнаёмім ніжэй.

Ⅰ.Ацэнка якасці РНК

У эксперыменце RT-qPCR пасля завяршэння экстракцыі РНК неабходна ацаніць якасць РНК, і наступны эксперымент можна праводзіць толькі пасля яго кваліфікацыі.Метады ацэнкі ўключаюць спектрафатометр, электрафарэз у гелі Agilent, аналіз Agilent 2100, сярод якіх найбольш часта выкарыстоўваюцца спектрафатометр і метад выяўлення электрафарэзу ў агарозным гелі.Варта адзначыць, што гэтыя два метады неабходна выкарыстоўваць разам для завяршэння выяўлення і аналізу канцэнтрацыі, чысціні і цэласнасці РНК, каб забяспечыць якасць РНК.

Адпаведны набор для ізаляцыі РНК: 

Набор для вылучэння агульнай РНК клетак

Высокаачышчаная і якасная агульная РНК можа быць атрымана з розных культывуемых клетак за 11 хвілін.

Набор для вылучэння агульнай РНК жывёл

Хутка і эфектыўна здабываць агульную РНК высокай чысціні і высокай якасці з розных тканак жывёл.

Спектрафатометр:

Спектрафатометр у асноўным выкарыстоўваецца для вызначэння канцэнтрацыі і чысціні РНК, але ён не можа вызначыць цэласнасць РНК і геномных рэшткаў.Сярод іх A260/280 і A260/230 з'яўляюцца важнымі параметрамі для вызначэння чысціні РНК, і чысціню РНК можна вызначыць у адпаведнасці з ваганнем іх значэнняў:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, што паказвае на тое, што чысціня РНК добрая;A260/280<1,9, што паказвае на тое, што ў РНК могуць быць рэшткі бялку;A260/280>2.1, што паказвае на магчымую частковую дэградацыю РНК, што можа быць дадаткова пацверджана электрафарэзам у агарозным гелі.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, што сведчыць аб добрай чысціні РНК;A260/230< 2,0, што паказвае на тое, што ў РНК могуць быць рэшткі арганічных рэагентаў, такіх як фенолы, этанол або цукру.

Электрафарэз у агарозном гелі:

Аналіз электрафарэзу ў агарозным гелі можа аналізаваць цэласнасць РНК, геном і бялковыя рэшткі, але не можа дакладна колькасна вызначыць канцэнтрацыю РНК або выявіць рэшткі арганічных рэагентаў.Возьмем, напрыклад, шаблоны эукарыятычнай РНК:

1. РНК падвергнулі электрафарэзу ў агарозном гелі.Калі на карце геля былі толькі тры асобныя паласы 28sRNA, 18sRNA і 5,8sRNA, гэта азначае, што вынятая РНК цэлая.Калі ёсць феномен зацягвання, гэта сведчыць аб частковай дэградацыі РНК.

2. Калі паміж клеевым адтулінай і паласой 28sRNA ёсць адзіная яркая паласа, магчыма, ёсць рэшткі геномнай ДНК.

3. Калі ў клеевым адтуліне з'яўляюцца палоскі, гэта сведчыць аб наяўнасці рэшткаў бялку і іншых высокамалекулярных рэчываў.

Ⅱ. Зваротная транскрыпцыя

Пасля завяршэння экстракцыі РНК яе трэба ператварыць у кДНК для наступных эксперыментаў, таму этап адвароту вельмі важны.Зваротная транскрыпцыя будзе ўведзена з выбару зваротнай транскрыптазы і праймера:

Выбар зваротнай транскрыптазы:

Тыповыя зваротныя транскрыптазы ўключаюць AMV RTase і MMLV RTase.РНКаза H AMV RTase валодае моцнай актыўнасцю, кароткай працягласцю сінтэзу, нізкай колькасцю сінтэзу і добрай тэрмічнай стабільнасцю (42 ~ 55 ℃).Актыўнасць РНКазы H MMLV RTase слабая, працягласць сінтэзу вялікая, колькасць сінтэзу высокая, а тэрмічная стабільнасць нізкая (37 ~ 42 ℃).

Паколькі фермент РНКаза H выконвае функцыю дэградацыі матрыцы РНК, MMLV са слабой актыўнасцю РНКазы H варта адбіраць пераважна падчас зваротнай транскрыпцыі, а пасля пазнейшай геннай інжынерыі цеплавая стабільнасць MMLV дасягнула якаснага скачка.Прымаючы ForegeneЗваротная транскрыптаза Foreasy (M-MLV для зваротнай транскрыпцыі) напрыклад, гэта новая зваротная транскрыптаза, экспрэсіруемая ў бактэрыях E. coli, створаных з выкарыстаннем тэхналогіі генетычнай рэкамбінацыі.Гэта рэкамбінантная ДНК-палімераза, якая сінтэзуе камплементарную ланцуг ДНК з адналанцуговай РНК, ДНК або гібрыда РНК:ДНК.Ён не мае актыўнасці РНКазы H, моцнай стабільнасці, моцнага сродства да РНК і высокай адчувальнасці выяўлення.

 

Зваротная транскрыптаза Foreasy (M-MLV для зваротнай транскрыпцыі)

Выбар грунтоўкі:

Звычайна праймеры RT дзеляцца на тры катэгорыі: аліга dT, выпадковыя праймеры і ген-спецыфічныя праймеры.Выберыце прыдатныя грунтоўкі для выкарыстання ў адпаведнасці з рознымі эксперыментальнымі патрабаваннямі.

1. Калі матрыца мае эукарыётычнае паходжанне і позняя кДНК выкарыстоўваецца для звычайнай ПЦР-ампліфікацыі, рэкамендуецца Oligo (dT);Калі наступны эксперымент выкарыстоўваецца толькі для кПЦР, Oligo (dT) рэкамендуецца змяшаць са выпадковымі праймерамі для павышэння эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі.

2. Калі шаблон паходзіць з пракарыётаў, для зваротнай транскрыпцыі трэба выбраць выпадковыя праймеры або генеспецыфічныя праймеры.

Ⅲ.кПЦР

Колькасная ацэнка флуарэсцэнцыі ў асноўным распрацоўваецца з выбару колькасных метадаў, прынцыпаў распрацоўкі праймераў, выбару ROX, канфігурацыі рэакцыйнай сістэмы і ўмоў рэакцыі і г.д.

Выбар колькасных метадаў:

Колькасныя метады падзяляюцца на адносныя колькасныя метады і абсалютныя колькасныя метады.Адносная колькасная ацэнка можа быць выкарыстана для выяўлення ўплыву пэўных метадаў лячэння на экспрэсію генаў, выяўлення розніцы ў экспрэсіі генаў у розны час і параўнання розніцы ў экспрэсіі генаў у розных тканінах.Абсалютная колькасная ацэнка можа выявіць колькасць нуклеінавай кіслаты ў вірусе і гэтак далей.Праводзячы эксперыменты, мы павінны выбраць адпаведныя колькасныя метады ў адпаведнасці з нашымі ўласнымі эксперыментамі.

Прынцыпы дызайну грунтоўкі:

Дызайн праймера для кПЦР наўпрост звязаны з эфектыўнасцю ампліфікацыі і спецыфікай прадукту.Такім чынам, правільны дызайн добрых праймераў з'яўляецца першым крокам паспяховай кПЦР.Пры распрацоўцы грунтоўкі варта звярнуць увагу на наступныя прынцыпы пры выкананні прынцыпу звычайнай распрацоўкі грунтоўкі:

1. Даўжыня мэтавага фрагмента кантралюецца ў межах ад 100 да 300 пн;

2. Крос-экзонны дызайн, каб пазбегнуць уплыву геномнай ДНК;

3. Сканструяваныя праймеры неабходна праверыць на эфектыўнасць ампліфікацыі, і толькі калі эфектыўнасць ампліфікацыі дасягне стандарту (90-110%), іх можна выкарыстоўваць для колькасных эксперыментаў;

4. Канцэнтрацыя праймера звычайна аптымізуецца паміж 0,1 мкм і 1,0 мкм.

ВыбарROX:

У працэсе колькаснай рэакцыі ROX можа раўнамерна рэгуляваць розніцу аптычнага шляху, памылку піпетавання або розніцу ў аб'ёме, выкліканую выпарэннем і кандэнсацыяй, паляпшаючы паўтаральнасць вынікаў.Аднак варта адзначыць, што выбар ROX звязаны з інструментам.Калі прыбор qPCR мае функцыю аўтаматычнай карэкцыі розніцы паміж адтулінамі, яму не трэба дадаваць ROX;у адваротным выпадку неабходна дадаць карэкцыю ROX.Маленькія партнёры пры куплі рэагентаў павінны быць у адпаведнасці з інструментам, які выкарыстоўваецца, каб выбраць правільны ROX, каб пазбегнуць наступных памылак.

Падрыхтоўка рэакцыйнай сістэмы:

Пераважней рэакцыйныя аб'ёмы 20 і 50 мкл.Пры складанні сістэмы варта звярнуць увагу на наступныя моманты:

1. Рэакцыйную сістэму трэба падрыхтаваць шляхам вентыляцыі ў звышчыстым варштаце, новы ddH₂O выкарыстоўваецца для кожнага эксперыменту;

2. Кожны эксперымент павінен падрыхтаваць NTC, каб праверыць, ці ёсць у сістэме забруджванне, і кожная пара праймераў павінна зрабіць NTC пры падрыхтоўцы сістэмы;

3. Каб вызначыць, ці ёсць рэшткі гДНК у матрыцы РНК, для кожнага ўзору для выяўлення можна прыгатаваць НЗТ;

4. Пры падрыхтоўцы сістэмы рэкамендуецца зрабіць не менш за 3 тэхнічных паўтораў для аднаго ўзору;

5. Калі шаблонам з'яўляецца кДНК, рэкамендуецца разбавіць у 5-10 разоў, каб паменшыць эфект інгібіравання сістэмы зваротнай транскрыпцыі ў эксперыменце КПЦР.Лепш даследаваць колькасць шаблону па градыенту, каб значэнне CT было паміж 20-30;

6. Вызначыць неабходную колькасць рэакцый, павялічыць на 5-10% на падставе колькасці рэакцый і разлічыць колькасць канфігурацыі аб'ёму;

7, сістэма рыхтуецца з выкарыстаннем прынцыпу папярэдняй сумесі, змешванне пасля цэнтрыфугавання і забеспячэнне адсутнасці бурбалак;

8, Наколькі гэта магчыма, выбірайце дапаможныя расходныя матэрыялы.

Звязаны набор RT-qPCR