RT-qPCR распрацаваны на аснове звычайнай тэхналогіі ПЦР.Ён дадае флуоресцентные хімікаты (флуоресцентные фарбавальнікі або флуоресцентные зонды) у традыцыйную рэакцыйную сістэму ПЦР і выяўляе працэс ПЦР-адпалу і пашырэння ў рэжыме рэальнага часу ў адпаведнасці з іх рознымі механізмамі люмінесцэнцыі.Змены флуоресцентного сігналу ў асяроддзі выкарыстоўваюцца для разліку колькасці змены прадукту ў кожным цыкле ПЦР.У цяперашні час найбольш распаўсюджанымі метадамі з'яўляюцца метад флуоресцентного фарбавальніка і метад зонда.

Метад флуоресцентного фарбавальніка:
Некаторыя флуарэсцэнтныя фарбавальнікі, такія як SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO і інш., самі па сабе не выпраменьваюць святло, але выпраменьваюць флуарэсцэнцыю пасля звязвання з малой баразёнкай дцДНК.Такім чынам, у пачатку рэакцыі ПЦР апарат не можа выявіць флуоресцентный сігнал.Калі рэакцыя пераходзіць да стадыі адпалу-падаўжэння (двухэтапны метад) або стадыі падаўжэння (трохэтапны метад), у гэты час падвойныя ланцугі адкрываюцца, і новая ДНК-палімераза.Па меры павелічэння колькасці цыклаў ПЦР усё больш і больш фарбавальнікаў спалучаюцца з дцДНК, і флуарэсцэнтны сігнал таксама пастаянна ўзмацняецца.Возьмем у якасці прыкладу SYBR Green Ⅰ.
Метад зонда:
Зонд Taqman - найбольш часта выкарыстоўваны зонд для гідролізу.На 5'-канцы зонда ёсць флуоресцентная група, звычайна FAM.Сам зонд - гэта паслядоўнасць, камплементарная гену-мішэні.На 3'-канцы флюарафора ёсць флуоресцентная група гашэння.У адпаведнасці з прынцыпам пераносу энергіі флуарэсцэнтнага рэзанансу (Förster resonance energy transfer, FRET), калі рэпарцёрная флуоресцентная група (донарная флуоресцентная малекула) і тушаючая флуоресцентная група (акцэптарная флуоресцентная малекула). Калі спектр узбуджэння перакрываецца і адлегласць вельмі блізкая (7-10 нм), узбуджэнне донарнай малекулы можа выклікаць флуарэсцэнцыю малекулы-акцэптара, пры гэтым аўтафлюарэсцэнцыя аслаблена.Такім чынам, у пачатку рэакцыі ПЦР, калі зонд вольны і непашкоджаны ў сістэме, рэпарцёрная флуоресцентная група не будзе выпраменьваць флуарэсцэнцыю.Пры адпале праймер і зонд звязваюцца з шаблонам.На стадыі падаўжэння палімераза бесперапынна сінтэзуе новыя ланцугі.ДНК-палімераза валодае 5'-3' экзонуклеазной актыўнасцю.Дасягнуўшы зонда, ДНК-палімераза гідролізуе зонд з шаблону, аддзяліць рэпарцёрную флуоресцентную групу ад тушыцельнай флуоресцентной групы і вызваліць флуоресцентный сігнал.Паколькі паміж зондам і шаблонам існуе адназначная сувязь, метад зонда пераўзыходзіць метад фарбавальніка з пункту гледжання дакладнасці і адчувальнасці тэсту.

Малюнак 1. Прынцып qRT-PCR

Афармленне грунтоўкі
прынцыпы:

Праймеры павінны быць распрацаваны ў кансерватыўнай вобласці серыі нуклеінавых кіслот і мець спецыфічнасць.

Лепш за ўсё выкарыстоўваць паслядоўнасць кДНК, і паслядоўнасць мРНК таксама прымальная.Калі няма, высвятліце канструкцыю вобласці cds паслядоўнасці ДНК.
Даўжыня флуарэсцэнтнага колькаснага прадукту складае 80-150 п.н., самая доўгая - 300 п.н., даўжыня праймера звычайна складае 17-25 асноў, і розніца паміж праймерамі вышэй і ніжэй па плыні не павінна быць занадта вялікай.

Утрыманне G + C складае ад 40% да 60%, а 45-55% з'яўляецца лепшым.
Значэнне TM знаходзіцца ў межах 58-62 градусаў.
Старайцеся пазбягаць дымераў праймераў і ўласных дымераў (не з'яўляцца больш за 4 пары паслядоўных камплементарных асноў) Шпількавая структура, калі гэта непазбежна, зрабіце ΔG<4,5 кДж/моль* Калі вы не можаце пераканацца, што гДНК была выдалена падчас зваротнай транскрыпцыі. Чыста, лепш распрацаваць праймеры інтрона *3' канец не можа быць зменены, і каб пазбегнуць AT, GC багатых абласцей, пазбягайце T/C, A/G бесперапынная структура (2-3) грунтоўкі і не-
спецыфічная Гамалогія гетэрагенна ампліфікаванай паслядоўнасці пераважна менш за 70% або мае 8 камплементарных асноў.
База дадзеных:
CottonFGD пошук па ключавых словах
Дызайн грунтоўкі:
Праймер IDT-qPCR

Малюнак 2. Старонка онлайн-інструмента для распрацоўкі праймераў IDT

Адлюстраванне старонкі вынікаў Fig3
Дызайн праймераў lncRNA:
lncRNA:тыя ж дзеянні, што і мРНК.
мікраРНК:Прынцып метаду ствалавой завесы: паколькі ўсе мікраРНК з'яўляюцца кароткімі паслядоўнасцямі даўжынёй каля 23 нт, прамое выяўленне ПЦР немагчыма выканаць, таму выкарыстоўваецца інструмент паслядоўнасці ствалавой завесы.Паслядоўнасць ствалавой пятлі ўяўляе сабой адналанцуговую ДНК даўжынёй каля 50 нт, якая сама па сабе можа ўтвараць структуру шпількі.3 'Канец можа быць распрацаваны як паслядоўнасць, камплементарная частковаму фрагменту мікраРНК, тады мэтавая мікраРНК можа быць злучана з паслядоўнасцю ствалавой пятлі падчас зваротнай транскрыпцыі, і агульная даўжыня можа дасягаць 70 п.н., што адпавядае даўжыні ампліфікаванага прадукту, вызначанай з дапамогай кПЦР.Дызайн праймера хваставой мікраРНК.
Спецыфічнае выяўленне ўзмацнення:
Анлайн-база дадзеных выбуху: выбух CottonFGD па падабенстве паслядоўнасці
Лакальны выбух: звярніцеся да выкарыстання Blast+ для лакальнага выбуху, Linux і macos могуць наўпрост стварыць лакальную базу дадзеных, сістэма win10 таксама можа быць зроблена пасля ўсталявання ubuntu bash.Стварэнне лакальнай базы дадзеных выбуху і лакальнага выбуху;адкрыць ubuntu bash на win10.
Заўвага: бавоўна ўзвышшаў і бавоўна марскіх астравоў з'яўляюцца тэтраплоіднымі культурамі, таму вынікам выбуху часта будзе два ці больш супадзенняў.Раней пры выкарыстанні кампакт-дыскаў NAU у якасці базы дадзеных для выканання выбуху можна было знайсці два гамалагічныя гены толькі з некалькімі адрозненнямі SNP.Звычайна два гамалагічныя гены не могуць быць падзеленыя з дапамогай грунтоўкі, таму яны разглядаюцца як аднолькавыя.Калі ёсць відавочная індэля, праймер звычайна распрацоўваецца на індэлі, але гэта можа прывесці да другаснай структуры праймера. Свабодная энергія становіцца вышэйшай, што прыводзіць да зніжэння эфектыўнасці ўзмацнення, але гэтага не пазбегнуць.

Выяўленне другаснай структуры грунтоўкі:
Крокі:адкрыйце oligo 7 → увядзіце паслядоўнасць шаблону → зачыніце падакно → захавайце → знайдзіце праймер на шаблоне, націсніце ctrl+D, каб усталяваць даўжыню праймера → прааналізуйце розныя другасныя структуры, такія як цела самадымерызацыі, гетэрадымер, шпілька, неадпаведнасць і г. д. Апошнія два малюнкі на малюнку 4 - гэта вынікі выпрабаванняў праймераў.Вынік пярэдняга праймера добры, няма відавочнай дымернай і шпількавай структуры, няма бесперапынных дадатковых асноў, і абсалютная велічыня свабоднай энергіі менш за 4,5, у той час як задняя праймер паказвае бесперапыннасць. 6 асноў з'яўляюцца дадатковымі, а свабодная энергія роўная 8,8;акрамя таго, больш сур'ёзны дымер з'яўляецца на 3'-канцы і з'яўляецца дымер з 4 паслядоўных асноў.Хоць свабодная энергія невысокая, 3'-дымер Chl можа сур'ёзна паўплываць на спецыфічнасць і эфектыўнасць узмацнення.Акрамя таго, неабходна праверыць наяўнасць шпілек, гетеродимеров і несупадзенняў.

Малюнак 3: вынікі выяўлення oligo7
Выяўленне эфектыўнасці ўзмацнення:
Эфектыўнасць ампліфікацыі рэакцыі ПЦР сур'ёзна ўплывае на вынікі ПЦР.Таксама ў qRT-PCR эфектыўнасць ампліфікацыі асабліва важная для колькасных вынікаў.Выдаліце ​​​​іншыя рэчывы, машыны і пратаколы з буфера рэакцыі.Якасць праймераў таксама мае вялікі ўплыў на эфектыўнасць ампліфікацыі QRT-PCR.Каб пераканацца ў дакладнасці вынікаў, колькаснае вызначэнне адноснай і абсалютнай флуарэсцэнцыі павінна вызначаць эфектыўнасць узмацнення праймераў.Прызнана, што эфектыўнасць ампліфікацыі qRT-PCR складае ад 85% да 115%.Ёсць два спосабу:
1. Метад стандартнай крывой:
а.Змяшайце кДНК
б.Градыентнае развядзенне
c.qPCR
d.Ураўненне лінейнай рэгрэсіі для разліку эфектыўнасці ўзмацнення
2. LinRegPCR
LinRegPCR - гэта праграма для аналізу даных RT-PCR у рэальным часе, таксама званых колькаснымі данымі ПЦР (кПЦР), заснаваных на SYBR Green або падобнай хіміі.Праграма выкарыстоўвае небазавыя скарэктаваныя даныя, выконвае базавую карэкцыю для кожнага ўзору асобна, вызначае акно лінейнасці, а затым выкарыстоўвае лінейны рэгрэсійны аналіз, каб падагнаць прамую лінію праз набор даных ПЦР.Па нахіле гэтай лініі разлічваецца эфектыўнасць ПЦР кожнага асобнага ўзору.Сярэдняя эфектыўнасць ПЦР на амплікон і значэнне Ct на ўзор выкарыстоўваюцца для разліку пачатковай канцэнтрацыі на ўзор, выражанай у адвольных адзінках флуарэсцэнцыі.Увод і вывад дадзеных ажыццяўляецца праз электронную табліцу Excel.Толькі ўзор
патрабуецца змешванне, без градыенту
неабходныя крокі:(У якасці прыкладу возьмем Bole CFX96, не зусім машыну з выразным ABI)
эксперымент:гэта стандартны эксперымент qPCR.
Вывад дадзеных qPCR:LinRegPCR можа распазнаваць дзве формы выходных файлаў: RDML або вынік колькаснага ўзмацнення.Фактычна, гэта значэнне выяўлення колькасці цыклаў і сігналу флуарэсцэнцыі машынай у рэжыме рэальнага часу, а ўзмацненне атрымліваецца шляхам аналізу значэння змены флуарэсцэнцыі эфектыўнасці лінейнага сегмента.
Выбар дадзеных: Тэарэтычна, значэнне RDML павінна быць прыдатным для выкарыстання.Мяркуецца, што праблема майго камп'ютара заключаецца ў тым, што праграмнае забеспячэнне не можа распазнаць RDML, таму я маю выходнае значэнне excel як зыходныя даныя.Рэкамендуецца спачатку выканаць прыблізны адбор даных, напрыклад, збой дадання ўзораў і г. д. Пункты можна выдаліць у выходных даных (вядома, вы не можаце іх выдаліць, LinRegPCR будзе ігнараваць гэтыя моманты на наступным этапе)

Мал. 5 Экспарт даных qPCR

Мал.6 выбар узораў-кандыдатаў

Увод дадзеных:Адкрыйце qualification amplification results.xls, → адкрыйце LinRegPCR → файл → прачытайце з excel → абярыце параметры, як паказана на малюнку 7 → OK → націсніце вызначыць базавыя паказчыкі

Мал.7 этапы ўводу даных linRegPCR

вынік:Калі няма паўтарэння, групаванне не патрабуецца.Калі ёсць паўторы, групоўку можна адрэдагаваць у групоўцы ўзораў, і назва гена ўводзіцца ў ідэнтыфікатар, пасля чаго той жа ген будзе аўтаматычна згрупаваны.Нарэшце, націсніце на файл, экспартуйце Excel і праглядзіце вынікі.Будуць адлюстраваны вынікі эфектыўнасці ўзмацнення і R2 кожнай лункі.Па-другое, пры падзеле на групы будзе адлюстроўвацца скарэкціраваная сярэдняя эфектыўнасць узмацнення.Пераканайцеся, што эфектыўнасць узмацнення кожнага праймера складае ад 85% да 115%.Калі ён занадта вялікі або занадта малы, гэта азначае, што эфектыўнасць узмацнення праймера дрэнная.

Малюнак 8 Вынік і выхад даных

Эксперыментальны працэс:
Патрабаванні да якасці РНК:
Чысціня:1.72.0 паказвае, што можа быць рэшткавы изотиоцианат.Чыстая нуклеінавая кіслата A260/A230 павінна быць каля 2. Калі ёсць моцнае паглынанне пры 230 нм, гэта сведчыць аб наяўнасці арганічных злучэнняў, такіх як іёны фената.Акрамя таго, яго можна выявіць з дапамогай электрафарэзу ў 1,5% агарозном гелі.Навядзіце маркер, таму што ssRNA не мае дэнатурацыі і лагарыфм малекулярнай масы не мае лінейнай залежнасці, і малекулярная маса не можа быць правільна выражана.Канцэнтрацыя: Тэарэтычнанеменш за 100нг/мкл, калі канцэнтрацыя занадта нізкая, чысціня звычайна нізкая, не высокая

Мал.9 РНК-гель

Акрамя таго, калі ўзор з'яўляецца каштоўным і канцэнтрацыя РНК высокая, рэкамендуецца аліквотаваць яго пасля экстракцыі і разбавіць РНК да канчатковай канцэнтрацыі 100-300нг/мкл для зваротнай транскрыпцыі.Упрацэс адваротнай транскрыпцыі, калі мРНК транскрыбуецца, для зваротнай транскрыпцыі выкарыстоўваюцца аліга (dt) праймеры, якія могуць спецыфічна звязвацца з хвастамі polyA, у той час як lncRNA і circRNA выкарыстоўваюць выпадковыя гексамерныя (Random 6 mer) праймеры для зваротнай транскрыпцыі агульнай РНК.Зараз многія кампаніі выпусцілі спецыяльныя камплекты для хвастоў.Для метаду ствалавой завесы метад хваста больш зручны, высокапрадукцыйны і эканоміць рэагенты, але эфект ад адрознення мікраРНК аднаго сямейства не павінен быць такім добрым, як метад ствалавой завесы.Кожны набор для зваротнай транскрыпцыі мае патрабаванні да канцэнтрацыі генаспецыфічных праймераў (сцеблавых завес).Унутраная спасылка, якая выкарыстоўваецца для мікраРНК, - U6.У працэсе інверсіі сцябла-пятлі трубку U6 трэба перавярнуць асобна, а пярэдні і задні грунтоўкі U6 трэба дадаць непасрэдна.І circRNA, і lncRNA могуць выкарыстоўваць HKG у якасці ўнутранай спасылкі.Увыяўленне кДНК,
калі няма праблем з РНК, кДНК таксама павінна быць у парадку.Аднак, калі мы імкнемся да дасканаласці эксперыменту, лепш за ўсё выкарыстоўваць унутраны эталонны ген (Reference gene, RG), які можа адрозніць gDNA ад cds.Як правіла, RG - гэта ген хатняй гаспадаркі., HKG), як паказана на малюнку 10;У той час я рабіў соевы бялок для захоўвання і выкарыстаў інтроны, якія змяшчаюць актын7, у якасці ўнутранай спасылкі.Памер амплифицированного фрагмента гэтага праймера ў gDNA складаў 452 bp, а калі ў якасці матрыцы выкарыстоўвалася кДНК, то ён складаў 142 bp.Потым вынікі тэсту паказалі, што частка кДНК насамрэч была забруджана гДНК, і гэта таксама даказала, што з вынікам зваротнай транскрыпцыі не было праблем, і яго можна было выкарыстоўваць у якасці шаблону для ПЦР.Бескарысна праводзіць электрафарэз у агарозным гелі непасрэдна з кДНК, і гэта дыфузная паласа, што не пераканаўча.

Мал. 10. Выяўленне кДНК

Вызначэнне ўмоў КПЦРяк правіла, няма праблем у адпаведнасці з пратаколам камплекта, у асноўным на этапе значэння tm.Калі падчас распрацоўкі праймераў некаторыя праймеры не былі добра распрацаваны, што прывяло да вялікай розніцы паміж значэннем tm і тэарэтычным 60°C, рэкамендуецца кДНК. Пасля таго, як узоры змешаны, запусціце градыентную ПЦР з праймерамі і старайцеся пазбягаць усталявання тэмпературы без палос у якасці значэння TM.

Аналіз дадзеных

Звычайны метад колькаснай ПЦР адноснай флуарэсцэнцыі ў асноўным адпавядае 2-ΔΔCT.Шаблон для апрацоўкі дадзеных.

Спадарожныя тавары:

Лёгкая ПЦР у рэальным часе^TM – Такман

Лёгкая ПЦР у рэальным часе^TM –СІБР ГРЫН І

RT Easy I (Майстар-прэмікс для сінтэзу першай ніткі кДНК)

RT Easy II (галоўны прэмікс для сінтэзу кДНК першай ніткі для кПЦР)