ПЦР у рэжыме рэальнага часу Easyᵀᴹ-Taqman
Апісанні камплектаў
2X Real PCR EasyTMMix-Taqman прадастаўляецца Real Time PCR EasyTM-Taqman kit - гэта новая сістэма папярэдняй сумесі, якая выкарыстоўвае спецыяльныя флуоресцентные зонды для рэакцый ампліфікацыі ПЦР у рэжыме рэальнага часу, якія могуць значна палепшыць спецыфічнасць прадукту і адчувальнасць рэакцыі.ROX пастаўляецца ў якасці фарбавальніка для ўнутранага кантролю.
2X Real PCR EasyTMMix-Taqman змяшчае унікальную ДНК-палімеразу Taq з гарачым пачаткам Foregene.У параўнанні са звычайнымі ферментамі Taq, ён мае такія перавагі, як высокая эфектыўнасць узмацнення, моцная ўдзельная здольнасць да ўзмацнення і нізкая хуткасць неадпаведнасці.Гэта можа паменшыць неспецыфічную ампліфікацыю і павысіць дакладнасць ПЦР.
Тэхнічныя характарыстыкі
Лёгкая ПЦР у рэальным часеTM-Такман | ||||
Склад набору (сістэма 20 мкл) | QP-01021 | QP-01022 | QP-01023 | QP-01024 |
200T | 500 т | 1000 т | 2000T | |
2×Сапраўдная ПЦРлёгкаTMЗмяшаць-Такман | 1 мл ×2 | 1.7 мл ×3 | 1.7 мл ×6 | 1.7 мл ×12 |
20×Эталонны фарбавальнік ROX | 200 мкл | 0,5ml | 1 мл | 1 мл × 2 |
ddH без ДНКаз2O | 1,7 мл | 1.7 мл ×2 | 10 мл | 20 мл |
Iінструкцыя | 1 | 1 | 1 | 1 |
Асаблівасці і перавагі
■ Просты—сумесь ПЦР у 2 разы для скарачэння памылак эксперыменту і часу працы
■ Спецыфічны—аптымізаваны буфер і фермент Taq з гарачым стартам могуць прадухіліць неспецыфічную ампліфікацыю і адукацыю дымера праймера
■ Высокая адчувальнасць - можа выяўляць нізкія копіі шаблону
■ Добрая ўніверсальнасць — сумяшчальнасць з большасцю прыбораў для колькаснай ПЦР у рэальным часе
Прыкладанне камплекта
qPCR аналіз
Працоўны працэс
Графічны
Захоўванне і тэрмін прыдатнасці
Гэты набор трэба захоўваць удалечыні ад святла і пры тэмпературы -20 ℃.Пры частым выкарыстанні яго таксама можна захоўваць пры тэмпературы 4 ℃ на працягу кароткага перыяду часу (10 дзён).
Няма сігналаў узмацнення
1. ДНК-палімераза Taq у наборы губляе сваю актыўнасць з-за няправільнага захоўвання або заканчэння тэрміну прыдатнасці набору.
Рэкамендацыя: Пацвердзіце ўмовы захоўвання набору;паўторна дадайце адпаведную колькасць ДНК-палімеразы Taq у сістэму ПЦР або купіце новы набор ПЦР у рэальным часе для адпаведных эксперыментаў.
2. У шаблоне ДНК шмат інгібітараў Taq ДНК-палімеразы.
Прапанова: ачысціце шаблон або паменшыце колькасць выкарыстоўванага шаблону.
3. Канцэнтрацыя Mg2+ не падыходзіць.
Рэкамендацыя: канцэнтрацыя Mg2+ у сумесі 2× Real PCR, якую мы прапануем, складае 3,5 мМ.Аднак для некаторых спецыяльных праймераў і шаблонаў канцэнтрацыя Mg2+ можа быць вышэй.Такім чынам, вы можаце непасрэдна дадаць MgCl2 для аптымізацыі канцэнтрацыі Mg2+.Для аптымізацыі рэкамендуецца кожны раз павялічваць Mg2+ на 0,5 ммоль.
4. Умовы ПЦР-ампліфікацыі не падыходзяць, а паслядоўнасць праймера або канцэнтрацыя неналежныя.
Прапанова: пацвердзіце правільнасць паслядоўнасці праймера і праймер не пагаршаецца;калі ўзмацненне сігналу дрэннае, паспрабуйце знізіць тэмпературу адпалу і адпаведным чынам адрэгуляваць канцэнтрацыю грунтоўкі.
5. Колькасць шаблону занадта малая або занадта вялікая.
Рэкамендацыя: выканайце градыентнае развядзенне лінеарызацыі шаблону і абярыце канцэнтрацыю шаблону з найлепшым эфектам ПЦР для эксперыменту ПЦР у рэальным часе.
NTC мае занадта высокае значэнне флуарэсцэнцыі
1. Забруджванне рэагентам падчас працы.
Рэкамендацыя: замяніце на новыя рэагенты для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.
2. Заражэнне адбылося падчас падрыхтоўкі рэакцыйнай сістэмы ПЦР.
Рэкамендацыя: падчас працы прымайце неабходныя меры абароны, такія як: апранайце латексныя пальчаткі, карыстайцеся наканечнікам піпеткі з фільтрам і г.д.
3. Праймеры пагаршаюцца, і дэградацыя праймераў прывядзе да неспецыфічнага ўзмацнення.
Прапанова: выкарыстоўвайце электрафарэз SDS-PAGE, каб вызначыць, ці пагаршаюцца праймеры, і заменіце іх новымі праймерамі для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.
Праймерны дымер або неспецыфічная ампліфікацыя
1. Канцэнтрацыя Mg2+ не падыходзіць.
Рэкамендацыя: канцэнтрацыя Mg2+ у сумесі 2× Real PCR EasyTM Mix, якую мы прапануем, складае 3,5 мм.Аднак для некаторых спецыяльных праймераў і шаблонаў канцэнтрацыя Mg2+ можа быць вышэй.Такім чынам, вы можаце непасрэдна дадаць MgCl2 для аптымізацыі канцэнтрацыі Mg2+.Для аптымізацыі рэкамендуецца кожны раз павялічваць Mg2+ на 0,5 ммоль.
2. Тэмпература ПЦР-адпалу занадта нізкая.
Прапанова: кожны раз павялічвайце тэмпературу ПЦР-адпалу на 1 ℃ або 2 ℃.
3. Прадукт ПЦР занадта доўгі.
Рэкамендацыя: даўжыня прадукту ПЦР у рэальным часе павінна складаць 100-150 біт, не больш за 500 біт.
4. Праймеры пагаршаюцца, і дэградацыя праймераў прывядзе да з'яўлення спецыфічнага ўзмацнення.
Прапанова: выкарыстоўвайце электрафарэз SDS-PAGE, каб вызначыць, ці пагаршаюцца праймеры, і заменіце іх новымі праймерамі для эксперыментаў ПЦР у рэальным часе.
5. Сістэма ПЦР няправільная, або сістэма занадта малая.
Прапанова: занадта малая рэакцыйная сістэма ПЦР прывядзе да зніжэння дакладнасці выяўлення.Лепш за ўсё выкарыстоўваць рэакцыйную сістэму, рэкамендаваную прыборам для колькаснай ПЦР, каб паўторна правесці эксперымент ПЦР у рэальным часе.
Дрэнная паўтаральнасць колькасных значэнняў
1. Прыбор няспраўны.
Прапанова: могуць быць памылкі паміж кожным адтулінай ПЦР прыбора, што прыводзіць да дрэннай узнаўляльнасці падчас рэгулявання тэмпературы або выяўлення.Калі ласка, праверце ў адпаведнасці з інструкцыямі адпаведнага прыбора.
2. Чысціня ўзору не вельмі добрая.
Рэкамендацыя: нячыстыя ўзоры прывядуць да дрэннай узнаўляльнасці эксперыменту, што ўключае ў сябе чысціню шаблону і праймераў.Лепш за ўсё паўторна ачысціць шаблон, а праймеры лепш за ўсё ачысціць SDS-PAGE.
3. Час падрыхтоўкі і захоўвання сістэмы ПЦР занадта вялікі.
Прапанова: выкарыстоўвайце ПЦР-сістэму ў рэальным часе для ПЦР-эксперыменту адразу пасля падрыхтоўкі і не пакідайце яе надоўга.
4. Умовы ПЦР-ампліфікацыі не падыходзяць, а паслядоўнасць праймера або канцэнтрацыя неналежныя.
Прапанова: пацвердзіце правільнасць паслядоўнасці праймера і праймер не пагаршаецца;калі ўзмацненне сігналу дрэннае, паспрабуйце знізіць тэмпературу адпалу і адпаведным чынам адрэгуляваць канцэнтрацыю грунтоўкі.
5. Сістэма ПЦР няправільная, або сістэма занадта малая.
Прапанова: занадта малая рэакцыйная сістэма ПЦР прывядзе да зніжэння дакладнасці выяўлення.Лепш за ўсё выкарыстоўваць рэакцыйную сістэму, рэкамендаваную прыборам для колькаснай ПЦР, каб паўторна правесці эксперымент ПЦР у рэальным часе.