Спецыфіка выяўлення
У большасці выпадкаў мэтай распрацоўкі праймераў з'яўляецца максімізацыя спецыфічнасці ПЦР.Гэта вызначаецца больш-менш прадказальным уплывам многіх зменных.Адной з важных зменных з'яўляецца паслядоўнасць на 3'-канцы праймера.
Важна адзначыць, што аналізы ПЦР, распрацаваныя для спецыфічнасці, з большай верагоднасцю падтрымліваюць высокую эфектыўнасць у шырокім дынамічным дыяпазоне, таму што аналіз не вырабляе неспецыфічныя прадукты ампліфікацыі, такім чынам канкуруючы з рэагентамі ПЦР або інгібіруючы асноўную рэакцыю ампліфікацыі.
Вядома, у некаторых выпадках спецыфічнасць не самая важная, напрыклад, калі мэта складаецца ў тым, каб колькасна вызначыць цесна звязаныя, але розныя ўзбуджальнікі, патрабуецца спецыяльны дызайн, стандарты аптымізацыі і праверкі.
Крывая плаўлення - гэта стандартны метад для ацэнкі спецыфічнасці ампліконаў, па меншай меры, з пункту гледжання таго, ці трэба ўзмацняць адну мішэнь.Аднак трэба падкрэсліць, што крывыя плаўлення могуць уводзіць у зман, таму што, напрыклад, на іх можа паўплываць камбінаваны эфект неаптымальных праймераў і нізкіх канцэнтрацый шаблону.
P5 |Крывая плаўлення паказвае зрухі Tm, атрыманыя ў выніку двух выяўленняў розных колькасцяў дзвюх ДНК-мішэняў.
А. Пры больш высокіх канцэнтрацыях (ad)) пасля завяршэння вымярэння кПЦР відавочнага дымера праймера няма.Калі канцэнтрацыя шаблону зніжаецца да 50 копій (e), неспецыфічны прадукт пачынае з'яўляцца і становіцца адзіным прадуктам з самай нізкай канцэнтрацыяй (f).
B. Тэст зафіксаваў аднолькавую Tms пры ўсіх мэтавых канцэнтрацыях, і не было відавочнага дымера праймера нават пры самай нізкай канцэнтрацыі (5 копій).Пры выкарыстанні гэтых двух метадаў выяўлення прадуктаў ампліфікацыі ў НТК не выяўлена.
P5 паказвае крывыя растварэння, атрыманыя з узорамі, у якіх шаблон прысутнічае ў розных канцэнтрацыях.P 5a паказвае, што пры дзвюх самых нізкіх канцэнтрацыях Tms атрыманых неспецыфічных прадуктаў ампліфікацыі ніжэй, чым у спецыфічных ампліконаў.
Відавочна, што гэты метад выяўлення не можа быць надзейна выкарыстаны для выяўлення мэтаў, якія існуюць у нізкіх канцэнтрацыях.
Цікава, што NTC, г.зн. узоры без ДНК наогул, не запісвалі (неспецыфічныя) прадукты ампліфікацыі, што паказвае на тое, што фонавая геномная ДНК можа ўдзельнічаць у неспецыфічнай ампліфікацыі/полімерызацыі.
Часам такія фонавыя праймеры і неспецыфічную ампліфікацыю немагчыма выправіць, але часта можна распрацаваць метад выяўлення, які не мае неспецыфічнай ампліфікацыі пры любой канцэнтрацыі шаблону і NTC (P 5b).
Тут нават запіс узмацнення мэтавай канцэнтрацыі з Cq 35 дасць канкрэтную крывую растварэння.Сапраўды гэтак жа NTCs не выяўлялі прыкмет неспецыфічнага ўзмацнення.Часам паводзіны выяўлення могуць залежаць ад маткавага раствора, і ў пэўных буферных складах выяўляецца толькі неспецыфічнае ўзмацненне, якое можа быць звязана з рознымі канцэнтрацыямі Mg2+.
Стабільнасць выяўлення
Аптымізацыя Ta з'яўляецца карысным крокам у працэсе эмпірычнай праверкі і аптымізацыі выяўлення qPCR.Ён дае прамое ўказанне трываласці набору праймераў, паказваючы тэмпературу (або тэмпературны дыяпазон), якая стварае самы нізкі Cq без узмацнення NTC.
Двух-чатырохразовая розніца ў адчувальнасці можа быць не важнай для людзей з высокай экспрэсіяй мРНК, але для дыягнастычных тэстаў гэта можа азначаць розніцу паміж станоўчымі і ілжываадмоўнымі вынікамі.
Уласцівасці Ta праймераў qPCR могуць моцна адрознівацца.Некаторыя тэсты не вельмі трывалыя, і калі яны не выконваюцца пры аптымальным значэнні Ta праймераў, яны хутка разбурацца.
Гэта важна, таму што гэты тып выяўлення часта праблематычны ў рэальным свеце, а чысціня ўзору, канцэнтрацыя ДНК або наяўнасць іншай ДНК могуць быць не аптымальнымі.
Акрамя таго, мэтавая колькасць копій можа адрознівацца ў шырокім дыяпазоне, а рэагенты, пластыкавы посуд або інструменты могуць адрознівацца ад тых, што выкарыстоўваліся пры падрыхтоўцы тэсту.
P6|Градыент тэмпературы паказвае розную трываласць выяўлення ПЦР.
A. Выкарыстоўваць Mastermix Sensifast SYBR Bioline (нумар па каталогу BIO-98050) для правядзення ПЦР на кДНК, атрыманай з РНК мозгу чалавека.
B. Выкарыстоўвайце прыбор CFX qPCR кампаніі Bio-Rad, каб запісаць карту ампліфікацыі і крывую растварэння апалену (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Графік ампліфікацыі і крывая плаўлення ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Графік ампліфікацыі і крывая растварэння GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs, запісаныя пры розных тэмпературах адпалу, паказваючы розніцу ў Cq, запісаных пры тэмпературным градыенце 7C.
P 6 паказвае тыповы вынік непажаданага тэсту, дзе кПЦР выконвалася з выкарыстаннем градыенту Tas паміж 59C і 67C (P 6a) з выкарыстаннем праймераў для трох генаў, характэрных для мозгу чалавека.
З графіка ампліфікацыі відаць, што праймеры Opalin далёкія ад ідэальных, таму што іх аптымальны дыяпазон Ta вельмі вузкі (малюнак 6b), гэта значыць, Cq шырока рассеяны, у выніку чаго Cqs значна параўноўваецца з іх аптымальным Cqs Low.
Гэты метад выяўлення нестабільны і можа прывесці да неаптымальнага ўзмацнення.Такім чынам, гэтую пару буквароў варта перарабіць.Акрамя таго, аналіз крывой плаўлення (устаўка) паказвае, што спецыфіка гэтага метаду выяўлення таксама можа быць праблематычнай, таму што крывая плаўлення кожнага Ta розная.
Метад выяўлення ACSBG1, паказаны ў P 6c, з'яўляецца больш надзейным, чым метад выяўлення Opalin вышэй, але ён усё яшчэ далёкі ад ідэальнага, і, верагодна, яго можна палепшыць.
Аднак мы падкрэсліваем, што паміж трываласцю і спецыфічнасцю няма неабходнай сувязі, таму што крывая растварэння, атрыманая гэтым метадам выяўлення, паказвае аднолькавае пікавае значэнне ва ўсіх Tas (устаўка).
З іншага боку, тэст на трываласць значна больш талерантны, ствараючы падобныя Cq ў шырокім дыяпазоне Tas, як у тэсце GFAP, паказаным у P 6d.
Розніца ў Cqs, атрыманых у тым жа дыяпазоне 8 градусаў Цэльсія, меншая за 1, і крывая растварэння (устаўка) пацвярджае характарыстыкі выяўлення ў гэтым дыяпазоне тэмператур.Варта адзначыць, што разлічаны Tas і фактычны дыяпазон Ta могуць моцна адрознівацца.
Ёсць шмат рэкамендацый, прызначаных дапамагчы даследчыкам распрацаваць эфектыўныя праймеры, большасць з якіх заснаваныя на даўно ўсталяваных правілах, і шмат увагі надаецца 3′-канцу праймераў.Часта рэкамендуецца ўключаць G або C на канцы 3' і дзве асновы G або C (заціск GC), але не больш за дзве з апошніх 5 асноў.
На практыцы гэтыя правілы могуць кіравацца даследчыкамі, але яны не абавязкова правільныя ва ўсіх абставінах.
P7 |3'-канец праймера мала ўплывае на спецыфічнасць або эфектыўнасць.
А. Становішча праймераў для гена HIF-1α чалавека (NM_181054.2).
B. Выкарыстоўвайце маткавы раствор Agilent Brilliant III SYBR Green (Кат. № 600882), каб павялічыць колькасць тэставых элементаў.
C. Графік ампліфікацыі і крывая плаўлення, запісаныя прыборам CFX qPCR кампаніі Bio-Rad і праймерамі 3′-канца.NTC паказаны чырвоным колерам.
D. Запіс Cqs кожнага тэставага элемента
Напрыклад, вынік у P 7 супярэчыць правілу 3′-канца.Усе распрацоўкі даюць у асноўным аднолькавыя вынікі, толькі дзве камбінацыі праймераў прыводзяць да неспецыфічнай ампліфікацыі NTC.
Аднак мы не можам падтрымаць эфект кліпа GC, таму што ў гэтым выпадку выкарыстанне A або T у якасці максімум 30 асноў не зніжае спецыфічнасць.
Тэст C, дзе праймер F заканчваецца на GGCC, сапраўды запісваў Cq у NTC, паказваючы, што можна пазбягаць гэтых паслядоўнасцей на 30-м канцы.Мы падкрэсліваем, што адзіны спосаб вызначыць найлепшую паслядоўнасць 3′-канца пары праймераў - эксперыментальна ацаніць некаторыя праймеры-кандыдаты.
Эфектыўнасць узмацнення
Важна адзначыць, што хоць неспецыфічнае выяўленне ПЦР ніколі не можа стаць спецыфічным, эфектыўнасць ампліфікацыі можна рэгуляваць і максымізаваць рознымі спосабамі шляхам змены фермента, маткавага раствора, дабавак і ўмоў цыклу.
Для ацэнкі эфектыўнасці ПЦР-дэтэкцыі лепш за ўсё выкарыстоўваць серыйнае развядзенне мэтавай нуклеінавай кіслаты ў 10 або 5 разоў, гэта значыць «метад стандартнай крывой».
Калі для атрымання стандартнай крывой выкарыстоўваюцца ПЦР-ампліконы або сінтэтычныя ДНК-мішэні, паслядоўныя развядзенні гэтых мішэняў трэба змяшаць з пастаяннай колькасцю фонавай ДНК (напрыклад, геномнай ДНК).
P8 |Крывая развядзення для ацэнкі эфектыўнасці ПЦР.
А. Выкарыстоўвайце праймеры для HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA і R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC і майстармікс Agilent Brilliant III SYBR Green (нумар па каталогу 600882) для ПЦР і ўмоў крывой плаўлення.
Б. 100 нг РНК падвергнулі зваротнай транскрыпцыі, развялі ў 2 разы, а серыйна разведзеныя ўзоры кДНК развялі ў 5 разоў да 1 нг геномнай ДНК чалавека.Крывая плаўлення паказана на ўрэзцы.
C. Рэакцыя RT, развядзенне і серыйнае развядзенне былі паўтораны для другога ўзору кДНК, і вынікі былі падобнымі.
P 8 паказвае дзве стандартныя крывыя з выкарыстаннем аднаго і таго ж метаду выяўлення на двух розных узорах кДНК, вынік - аднолькавая эфектыўнасць, каля 100%, і значэнне R2 таксама падобнае, гэта значыць ступень адпаведнасці паміж эксперыментальнымі дадзенымі і лініяй рэгрэсіі або Ступень лінейнасці даных.
Дзве стандартныя крывыя супастаўныя, але не зусім аднолькавыя.Калі мэтай з'яўляецца дакладнае колькаснае вызначэнне мэты, неабходна адзначыць, што недапушчальна прадастаўляць разлік колькасці копій без тлумачэння нявызначанасці
P9 |Нявызначанасць вымярэнняў, звязаная з колькасным вызначэннем з выкарыстаннем стандартнай крывой.
А. Выкарыстоўвайце праймеры для GAPDH (NM_002046) для правядзення ПЦР і ўмоў крывой плаўлення.F: ACAGTTGCCATGTAGACC і R: TAACTGGTTGAGCACAGG і майстар-мікс Bioline Sensifast SYBR (каталожны нумар BIO-98050).
B. Дыяграма ампліфікацыі, крывая плаўлення і стандартная крывая, запісаныя прыборам CFX qPCR кампаніі Bio-Rad.
C. Стандартны графік крывой і 95% даверны інтэрвал (ДІ).
D. Колькасць копій і 95% даверны інтэрвал трох значэнняў Cq, атрыманых з крывой развядзення.
P 9 паказвае, што для аптымізаванага тэсту ўласцівая зменлівасць адной стандартнай крывой складае прыблізна 2 разы (95% даверны інтэрвал, ад мінімуму да максімуму), што можа быць найменшай зменлівасцю, якую можна чакаць.
Звязаны прадукт:
Набор Animal Tissue Direct PCR
Час публікацыі: 30 верасня 2021 г
