Усе гавораць аб прынцыпе эксперыменту qRT-PCR, дызайне грунтоўкі, інтэрпрэтацыі вынікаў і г.д., але я думаю, што я павінен падзяліцца з вамі эксперыментальнай працай qRT-PCR.Невялікая, але справа ў выніках.
Перш чым рабіць qRT-PCR, мы павінны мець дакладнае разуменне нашай уласнай РНК і метадаў працы.Бо нашы намаганні накіраваны на вынік, а не проста на практыку.Такім чынам, перш чым рабіць qRT-PCR, нам трэба вызначыць наступныя праблемы (некаторыя з якіх дастасавальныя толькі да SYBR).
1 Вы ўпэўнены, што ваша РНК не дэградавала?
NanoDrop 2000 можа вызначаць толькі канцэнтрацыю і чысціню РНК, але не можа вызначыць цэласнасць РНК.
Значэнне РНК (лік інтэнсіўнасці РНК) можа адлюстроўваць цэласнасць РНК, якая выяўляецца сістэмай біяаналізатара Agilent 2100.
Мал. Прынцыповая дыяграма значэнняў RIN для розных узораў РНК (эўкарыёт)
Аднак у лабараторыях звычайна няма біяаналізатара Agilent 2100.У гэтым выпадку мы можам выявіць праз фармальдэгідны гель, але патрэба ў агульнай колькасці РНК высокая, таму самы хуткі метад - выкарыстанне звычайнага гелевага электрафарэзу.Патрабуецца знаходжанне ў асяроддзі без нуклеазы, таму неабходна прамыць рэзервуар для электрафарэзу, флакон з золем, дужку з гелем і расчоскі вадой з DEPC.Агароза таксама не ўтрымлівае нуклеазы (пры ўмове, што яна толькі што адкрыта), а загрузны буфер павінен быць як мага больш свежым, з 1,2% гелем.
Звярніце ўвагу, што гель павінен цалкам растварыцца, у адваротным выпадку ён выкліча неаднародныя палосы, як паказана ва ўзоры 9 на малюнку.Калі напружанне занадта высокае або працуе занадта доўга, гэта прывядзе да выпрацоўкі цяпла і дэградацыі РНК, таму напружанне і час трэба разумна кантраляваць.Акрамя таго, прагонка геля можа таксама дадаткова вызначыць, ці ёсць рэшткі ДНК ва ўзоры, і назіраць, ці ёсць вялікая колькасць захаваных палос у дазавальнай лунцы.
Малюнак.Выяўленне РНК гель-электрафарэзам
2 Вы ўпэўнены ў канцэнтрацыі вашай кДНК?
Вопыт старэйшых братоў у лабараторыі сведчыць аб тым, што кДНК сістэмы 20 мкл, атрыманая пры кожнай інверсіі, непасрэдна разводзіцца ў 20 разоў, у той час як доктарскія сёстры разводзяць у 10 разоў.Звычайна я залежу ад сітуацыі.Паколькі якасць РНК, згаданай кожным чалавекам, розная, узровень адвароту таксама розны, і тэхналогія адвароту можа быць нестабільнай.
Такім чынам, кожны раз, калі я атрымліваю зваротную кДНК, я спачатку разбаўлю яе прыкладна ў 3 разы, а потым выкарыстоўваю ген гаспадаркі, каб зрабіць RT-PCR, колькасць цыклаў звычайна складае 25 цыклаў, каб вызначыць канкрэтную канцэнтрацыю, а потым вызначыць канчатковы каэфіцыент развядзення.
3 Вы ўпэўненыя, што вашы праймеры простыя ў выкарыстанні?
Ён можа прайсці крывую плаўлення qRT-PCR, але гэта ўсё роўна каштуе грошай.Для лабараторый без вялікіх грошай, калі яны атрымліваюць шмат праймераў, яны могуць выкарыстоўваць звычайную RT-PCR, каб убачыць, ці з'яўляецца гэта адна паласа, і вызначыць спецыфічнасць праймераў.Калі ў лабараторыі няма недахопу ў грошах, спецыфіку ўсіх праймераў можна вызначыць адзін раз па крывой плаўлення.
4 Вы ўпэўнены, што ўмовы вашага эксперыменту падыходзяць?
SYBR павінен быць абаронены ад моцнага святла, таму паспрабуйце выключыць верхняе святло пры даданні рэагента SYBR, а для завяршэння трэба выкарыстоўваць толькі цьмянае святло.
Захоўвайце SYBR пры тэмпературы 4°C.Пры выкарыстанні асцярожна пераварочвайце ўверх і ўніз, каб добра змяшаць, каб пазбегнуць успеньвання, і не ўзбівайце энергічна.
Некаторыя малодшыя сёстры любяць маляваць пазнакі на дошцы ПЦР, баючыся пераблытаць узоры, што няправільна.Паколькі вашы маркеры вельмі верагодна паўплываюць на збор флуарэсцэнтных сігналаў, я звычайна рэкамендую юнакам выкарыстоўваць эксперыментальныя сшыткі, каб дапамагчы ў памяці, як паказана ніжэй.
Малюнак.Схема загрузкі ўзору qRT-PCR
5 Вы ўпэўнены, што робіце гэта правільна?
Абавязкова надзець пальчаткі, надзець пальчаткі, надзець пальчаткі і сказаць важныя рэчы тры разы.
Каб паменшыць уздзеянне святла на SYBR, мне асабіста падабаецца спачатку дадаць шаблон, як паказана на малюнку ніжэй.Згодна з вопытам, даданне невялікай колькасці шаблона можа выклікаць памылкі выбаркі.Такім чынам, каб звесці да мінімуму памылку, выкліканую даданнем невялікай колькасці шаблону, я звычайна падвойваю ўзор яшчэ раз і падвойваю колькасць пры даданні ўзору, каб паменшыць колькасць дададзенай H2O2.
Малюнак.Прынцыповая схема загрузкі qRT-PCR
Затым наладзьце сістэму qRT-PCR наступным чынам.
Малюнак.Схема падрыхтоўкі сістэмы qRT-PCR
ЗАЎВАГА: працэс канфігурацыі трэба выконваць на лёдзе.
Пасля дадання ўзору наляпіце празрыстую плёнку.Старайцеся не дакранацца да паверхні празрыстай герметызавальнай плёнкі рукамі, проста дзейнічайце з прасторы па абодва бакі плёнкі.Таму што адбіткі пальцаў таксама могуць уплываць на збор флуарэсцэнтных сігналаў.Затым выкарыстоўвайце цэнтрыфугу для хуткай цэнтрыфугі на працягу 10 с на нізкай хуткасці, каб узор не павіс на сцяне.
Спадарожныя тавары:
Час публікацыі: 28 красавіка 2023 г
