ПЦР у рэальным часе, таксама вядомая як колькасная ПЦР або кПЦР, - гэта метад маніторынгу ў рэальным часе і аналізу прадуктаў ампліфікацыі ПЦР.
Паколькі колькасная ПЦР мае такія перавагі, як простая эксплуатацыя, хуткасць і зручнасць, высокая адчувальнасць, добрая паўтаральнасць і нізкі ўзровень заражэння, яна шырока выкарыстоўваецца ў медыцынскіх тэстах, ацэнцы эфектыўнасці лекаў, даследаванні экспрэсіі генаў, трансгенных даследаваннях, выяўленні генаў, выяўленні патагенаў, выяўленні жывёл і раслін., тэставанне прадуктаў харчавання і іншыя сферы.
Такім чынам, незалежна ад таго, займаецеся вы фундаментальнымі даследаваннямі ў галіне навук аб жыцці, ці супрацоўнікі фармацэўтычных кампаній, жывёлагадоўчых кампаній, харчовых кампаній, ці нават супрацоўнікі інспекцыі ўезду-выезду і каранціну, аддзелаў экалагічнага маніторынгу, бальніц і іншых падраздзяленняў, вы будзеце ў большай ці меншай ступені падвяргацца Або вам трэба ведаць веды па авалоданні колькаснай ПЦР.

Прынцып ПЦР у рэальным часе

ПЦР у рэальным часе - гэта метад, пры якім флуоресцентные субстанцыі дадаюцца ў рэакцыйную сістэму ПЦР, і інтэнсіўнасць сігналу флуарэсцэнцыі ў працэсе ПЦР-рэакцыі кантралюецца ў рэжыме рэальнага часу прыборам колькаснай ПЦР, і, нарэшце, эксперыментальныя дадзеныя аналізуюцца і апрацоўваюцца.

【Крывая ўзмацнення】- крывая, якая апісвае дынамічны працэс ПЦР.Крывая ампліфікацыі ПЦР - гэта не стандартная экспанентная крывая, а сігмападобная крывая.

[Платформерная фаза крывой узмацнення]З павелічэннем колькасці цыклаў ПЦР, інактывацыі ДНК-палімеразы, вычарпаннем dNTP і праймераў і інгібіраваннем рэакцыі сінтэзу пабочным прадуктам рэакцыі пірафасфатам і г.д. ПЦР не заўсёды пашыраецца ў геаметрычнай прагрэсіі., і ў рэшце рэшт выйдзе на плато.

[Вобласць экспанентнага росту крывой узмацнення]Хоць фаза плато моцна вар'іруецца, у пэўнай вобласці экспанентнага росту крывой ампліфікацыі паўтаральнасць вельмі добрая, што вельмі важна для колькаснага аналізу ПЦР.

[Парогавае значэнне і значэнне Ct]Мы ўсталёўваем лімітавае значэнне выяўлення флуарэсцэнцыі ў адпаведнай пазіцыі ў вобласці экспанентнага росту крывой ампліфікацыі, а менавіта парогавае значэнне (Threshold).Скрыжаванне парогавага значэння і крывой ампліфікацыі з'яўляецца значэннем Ct, гэта значыць значэнне Ct адносіцца да колькасці цыклаў (Парогавы цыкл), калі дасягаецца парогавае значэнне.

Графік ніжэй выразна паказвае залежнасць паміж парогавай лініяй і крывой ампліфікацыі, парогам і значэннем Ct.

【Як колькасна вызначыць?】

Матэматычнай тэорыяй было даказана, што значэнне Ct мае адваротную лінейную залежнасць ад лагарыфма колькасці пачатковых шаблонаў.ПЦР у рэжыме рэальнага часу кантралюе прадукты ампліфікацыі ПЦР у рэжыме рэальнага часу і вызначае іх колькасць падчас фазы экспанентнай ампліфікацыі.

Для кожнага цыклу ПЦР ДНК павялічвалася ў геаметрычнай прагрэсіі ў 2 разы і неўзабаве дасягнула плато.

Мяркуючы, што колькасць зыходнай ДНК роўна A₀ , пасля n цыклаў тэарэтычная колькасць прадукту ДНК можа быць выражана як:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Тады, чым больш пачатковая колькасць ДНК A 0, тым хутчэй колькасць прадукту ампліфікацыі дасягне значэння выяўлення An, а колькасць цыклаў пры дасягненні An з'яўляецца значэннем Ct.Гэта значыць, чым больш першапачатковая колькасць ДНК A 0, тым раней крывая ампліфікацыі дасягае піка, і адпаведна менш неабходная колькасць цыклаў n.

Мы праводзім градыентнае развядзенне стандарту вядомай канцэнтрацыі і выкарыстоўваем яго ў якасці шаблону для ПЦР у рэальным часе, пасля чаго праз роўныя прамежкі часу будзе атрымана серыя крывых ампліфікацыі ў парадку пачатковай колькасці ДНК ад большага да меншага.У адпаведнасці з лінейнай залежнасцю паміж значэннем Ct і лагарыфмам колькасці стартавых шаблонаў, a[стандартная крывая] можа быць створана.

Падставіўшы значэнне Ct ўзору з невядомай канцэнтрацыяй у стандартную крывую, можна атрымаць пачатковую колькасць шаблону ўзору з невядомай канцэнтрацыяй, што з'яўляецца колькасным прынцыпам ПЦР у рэальным часе.

Метад выяўлення ПЦР у рэальным часе

ПЦР у рэжыме рэальнага часу выяўляе прадукты ампліфікацыі ПЦР шляхам вызначэння інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі ў рэакцыйнай сістэме.

Прынцып метаду ўбудавання флуарэсцэнтнага фарбавальніка】

Флуарэсцэнтныя фарбавальнікі, такія як TB Green ®, могуць неспецыфічна звязвацца з двухцепочечной ДНК у ПЦР-сістэмах і флуарэсцаваць пры звязванні.

Інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі ў рэакцыйнай сістэме ўзрастала ў геаметрычнай прагрэсіі з павелічэннем колькасці цыклаў ПЦР.Выяўляючы інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі, колькасць ампліфікацыі ДНК у рэакцыйнай сістэме можна кантраляваць у рэжыме рэальнага часу, а затым колькасць пачатковай матрицы ў пробе можна адваротна ацаніць.

【Прынцып метаду люмінесцэнтнага зонда】

люмінесцэнтны зондуяўляе сабой паслядоўнасць нуклеінавай кіслаты з флуоресцентной групай на 5'-канцы і гашаючай групай на 3'-канцы, якая можа спецыфічна звязвацца з матрыцай.Калі зонд непашкоджаны, флуарэсцэнцыя, выпраменьваная флюарафорам, гасіцца групай тушэння і не можа флуарэсцэнтаваць.Калі зонд раскладаецца, флуарэсцэнтнае рэчыва будзе дысацыяваць і выпраменьваць флуарэсцэнцыю.

У раствор для рэакцыі ПЦР дадаюць флуоресцентный зонд.У працэсе адпалу флуоресцентный зонд будзе звязвацца з пэўным становішчам шаблону.Падчас працэсу падаўжэння экзануклеазная актыўнасць 5′→3′ фермента ПЦР можа расшчапляць флуарэсцэнтны зонд, гібрыдызаваны з матрыцай, і флуарэсцэнтнае рэчыва раз'ядноўваецца з выпраменьваннем флуарэсцэнцыі.Вызначыўшы інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі зонда ў рэакцыйнай сістэме, можна дасягнуць мэты маніторынгу колькасці ампліфікацыі прадукту ПЦР.

【Выбар метаду флуарэсцэнтнага выяўлення】

Калі ён выкарыстоўваецца для адрознення паслядоўнасцяў з высокай гамалогіяй і выканання мультыплекснай ПЦР-дэтэкцыі, напрыклад аналізу тыпу SNP, метад флуарэсцэнтнага зонда незаменны.
Для іншых эксперыментаў ПЦР у рэальным часе можна выкарыстоўваць просты, лёгкі і недарагі метад флуоресцентной хімеры.

зонды Моцная спецыфічнасць, здольныя да мультыплекснай ПЦР

Недахоп

Высокія патрабаванні да спецыфічнасці ампліфікацыі;

немагчыма выканаць мультыплексную ПЦР. Неабходнасць распрацоўкі спецыяльных зондаў, высокі кошт;

часам канструкцыя зонда складаная

Спадарожныя тавары: