У эксперыментах qPCR дызайн праймера таксама з'яўляецца вельмі важным звяном.Прыдатнасць праймераў цесна залежыць ад таго, ці дасягае эфектыўнасць узмацнення стандарту, ці з'яўляюцца прадукты ўзмацнення спецыфічнымі і ці даступныя эксперыментальныя вынікі.
Такім чынам, як палепшыць спецыфічнасць праймера кПЦР?Высокая эфектыўнасць узмацнення?
Сёння мы разам распрацуем праймеры qPCR, і дазволь распрацоўцы праймераў qPCR стаць эфектыўным навыкам вывучэння ведаў у эксперыментах.
Пры распрацоўцы праймераў для qPCR звычайна звяртайце ўвагу на наступныя моманты: праймеры павінны быць распрацаваны як мага больш праз інтроны, даўжыня прадукту павінна быць 100-300 п.о., значэнне Tm павінна быць як мага бліжэй да 60°C, а праймеры вышэй і ніжэй па плыні павінны быць як мага бліжэй, а канец праймера павінен быць G або C і г.д. пачакайце.
1. Дызайн праймераў, якія ахопліваюць інтроны
Пры распрацоўцы праймераў кПЦР выбар праймераў, распрацаваных па інтронах, можа прадухіліць ампліфікацыю матрыцы гДНК, і ўсе прадукты атрымліваюцца ў выніку ампліфікацыі кДНК, што дазваляе выключыць уплыў забруджвання гДНК.
2. Даўжыня грунтоўкі
Даўжыня праймера звычайна складае ад 18-30 нт, а даўжыню прадукту ампліфікацыі трэба кантраляваць у межах 100-300 п.о., наколькі гэта магчыма.
Калі праймер занадта кароткі, гэта прывядзе да неспецыфічнага ўзмацнення, а калі ён занадта доўгі, ён лёгка ўтворыць другасную структуру (напрыклад, структуру шпількі).Калі прадукт ампліфікацыі занадта доўгі, ён не падыходзіць для рэакцыі палімеразы, што паўплывае на эфектыўнасць ампліфікацыі ПЦР.
3. Змест GC і значэнне Tm
Утрыманне GC у праймерах павінна кантралявацца ў межах ад 40% да 60%.Калі ён занадта высокі або занадта нізкі, гэта не спрыяе пачатку рэакцыі.Змест GC прамога і зваротнага праймераў павінна быць блізкім да таго ж, каб атрымаць аднолькавае значэнне Tm і тэмпературу адпалу.
Значэнне Tm павінна быць у межах 55-65°C, наколькі гэта магчыма, звычайна каля 60°C, а значэнне Tm уверх і ўніз па плыні павінна быць як мага бліжэй, пажадана не больш за 4°C.
4. Пазбягайце выбару A на 3'-канцы праймера
Калі 3'-канец праймера не супадае, існуюць вялікія адрозненні ў эфектыўнасці сінтэзу розных асноў.Калі апошняй асновай з'яўляецца А, яна таксама можа ініцыяваць ланцуговы сінтэз нават у выпадку неадпаведнасці, а калі апошняй асновай з'яўляецца Т Калі , эфектыўнасць індукцыі неадпаведнасці значна зніжаецца.Такім чынам, паспрабуйце пазбягаць выбару А на 3' канцы праймера, а лепш выбраць Т.
Калі гэта праймер зонда, 5'-канец зонда не можа быць G, таму што нават калі адна база G падключана да флуоресцентной рэпарцёрнай групы FAM, G таксама можа гасіць флуоресцентный сігнал, выпраменьваны групай FAM, што прыводзіць да ілжываадмоўных вынікаў.З'яўляюцца.
5. Базавае размеркаванне
Размеркаванне чатырох асноў у праймеры пераважна выпадковае, пазбягаючы больш чым 3 паслядоўных G або C на 3' канцы, і больш чым 3 паслядоўныхG або C лёгка стварыць спалучэнне ў GC-багатай вобласці паслядоўнасці.
6. Вобласць дызайну грунтоўкі павінна пазбягаць складаных другасных структур.
Другасная структура, утвораная адзінкавым ланцугом прадукту ампліфікацыі, будзе ўплываць на плаўнае праходжанне ПЦР.Загадзя прагназуючы, ці ёсць другасная структура ў паслядоўнасці-мішэні, старайцеся пазбягаць гэтай вобласці пры распрацоўцы праймераў.
7. Самі праймеры і паміж праймерамі павінны старацца пазбягаць паслядоўных дадатковых асноў.
Не можа быць паслядоўнай 4-асноўнай камплементарнасці паміж самім праймерам і праймерам.Праймер сам па сабе не павінен мець дадатковай паслядоўнасці, інакш ён сам згорнецца, утвараючы структуру шпількі, што паўплывае на камбінацыю адпалу праймера і шаблону.
Камплементарныя паслядоўнасці не могуць існаваць паміж праймерамі вышэй і ніжэй па плыні.Узаемадапаўняльнасць паміж праймерамі прывядзе да адукацыі дымераў праймераў, што знізіць эфектыўнасць ПЦР і нават паўплывае на колькасную дакладнасць.Калі структуры праймер-дымер і шпілька непазбежныя, значэнне △G не павінна быць занадта высокім (павінна быць менш за 4,5 ккал/моль).
8. Праймеры ўзмацняюць мэтавы канкрэтны прадукт.
Канчатковая мэта выяўлення qPCR - зразумець колькасць гена-мішэні.Калі адбываецца неспецыфічнае ўзмацненне, колькаснае вызначэнне будзе недакладным.Такім чынам, пасля распрацоўкі праймераў іх трэба праверыць з дапамогай BLAST, а спецыфічнасць прадуктаў параўнаць у базе дадзеных паслядоўнасцей.
Далей мы возьмем чалавечы ген GAS6 (спецыфічны прыпынак росту 6) у якасці прыкладу для распрацоўкі праймераў qPCR.
01 запыт ген
Homo GAS6праз NCBI.Тут мы павінны звярнуць увагу на параўнанне назвы гена і віду, каб пераканацца, што яны супадаюць.
02 Знайдзіце паслядоўнасць гена
(1) Калі мэтавай паслядоўнасцю з'яўляецца геномная ДНК, выберыце першую, якая з'яўляецца паслядоўнасцю геномнай ДНК гена.
(2) Калі мэтавай паслядоўнасцю з'яўляецца мРНК, выберыце другую.Пасля ўводу націсніце «CDS» у табліцы ніжэй.Карычневая фонавая паслядоўнасць - гэта паслядоўнасць кадавання гена.
03 Праймеры для дызайну
Увайдзіце ў інтэрфейс Primer-BLAST
Увядзіце парадкавы нумар гена або паслядоўнасць у фармаце Fasta уверсе злева і запоўніце адпаведныя параметры.

Націсніце «Атрымаць праймеры», і NCBI з'явіцца, каб паведаміць вам, што такі выбар параметраў будзе ўзмоцнены для іншых варыянтаў зрошчвання.Мы можам праверыць розныя варыянты зрошчвання і прадставіць іх, каб атрымаць адпаведную пару праймераў (як паказана на малюнку ніжэй).Гэты працэс можа заняць дзясяткі секунд.
Тэмпературы адпалу гэтых пар праймераў складаюць каля 60°C.У адпаведнасці з мэтай эксперыменту выбірайце праймеры з сярэдняй даўжынёй, добрай спецыфічнасцю і меншым самадапаўненнем праймераў для эксперыменту, і ўзровень поспеху будзе даволі высокім!
04Праверка спецыфічнасці праймера
Фактычна, акрамя распрацоўкі праймераў, Primer-Blast можа таксама ацаніць праймеры, якія мы распрацавалі самі.Вярніцеся на старонку дызайну праймера, увядзіце праймеры вышэй і ніжэй па плыні, якія мы распрацавалі, і іншыя параметры не будуць карэкціравацца.Пасля адпраўкі вы можаце ўбачыць, ці існуе пара праймераў і ў іншых генах.Калі ўсе яны адлюстроўваюцца на гене, які мы хочам узмацніць, гэта азначае, што спецыфічнасць гэтай пары праймераў вялікая!(Напрыклад, гэта адзіны вынік запыту праймера!)

05 Ацэнка якасці грунтоўкі
Які тып праймера з'яўляецца «ідэальным» праймерам, які спалучае «эфектыўнасць узмацнення на ўзроўні», «палепшаныя характарыстыкі прадукту» і «надзейныя эксперыментальныя вынікі»?
Эфектыўнасць узмацнення

крывая плаўлення
Эфектыўнасць ампліфікацыі праймераў дасягае 90%-110%, што азначае, што эфектыўнасць ампліфікацыі добрая, а крывая плаўлення мае адзіны пік і звычайна Tm>80°C, што азначае, што спецыфічнасць ампліфікацыі добрая.
 
Спадарожныя тавары:
ПЦР у рэжыме рэальнага часу Easy–SYBR GREEN I
ПЦР у рэальным часе Easy-Taqman