Аснова дызайну грунтоўкі (99% праблем можна вырашыць)
1. Даўжыня буквара: падручнік патрабуе 15-30 bp, звычайна каля 20 bp.Рэальны стан лепш быць 18-24bp для забеспячэння спецыфічнасці, але чым даўжэй, тым лепш, занадта доўгі праймер таксама знізіць спецыфічнасць і знізіць ураджайнасць.
2. Прамежак ампліфікацыі праймера: 200-500 bp падыходзіць, і фрагмент можа быць пашыраны да 10kb пры пэўных умовах.
3. База грунтоўкі: утрыманне G+C павінна складаць 40-60%, занадта малы эфект узмацнення G+C не з'яўляецца добрым, занадта шмат G+C лёгка з'яўляецца неспецыфічнымі палосамі.ATGC лепш размяркоўваць выпадковым чынам, пазбягаючы кластараў з больш чым 5 пурынавых або пірымідынавых нуклеатыдаў.Multi-gc для 5'-канца і прамежкавых паслядоўнасцей для павышэння стабільнасці, пазбягайце багатага GC на 3'-канцы, адсутнасці GC для апошніх 3 асноў або адсутнасці GC для 3 з апошніх 5 асноў.
4. Пазбягайце другаснай структуры ў праймерах і пазбягайце камплементацыі паміж двума праймерамі, асабліва камплементацыі на 3'-канцы, у адваротным выпадку ўтворыцца дымер праймера і згенеруюцца неспецыфічныя ампліфікаваныя палосы.
5. Асновы на 3'-канцы праймераў, асабліва апошняя і перадапошняя асновы, павінны быць строга парнымі, каб пазбегнуць няўдачы ПЦР з-за няспараных канцавых баз.
6. Праймеры маюць або могуць быць дададзены з адпаведнымі сайтамі расшчаплення, і ампліфікаваная паслядоўнасць-мішэнь пераважна павінна мець адпаведныя сайты расшчаплення, што вельмі карысна для аналізу расшчаплення або малекулярнага кланавання.
7. Спецыфічнасць праймераў: праймеры не павінны мець відавочнай гамалогіі з іншымі паслядоўнасцямі ў базе дадзеных паслядоўнасцей нуклеінавых кіслот.
8. Навучыцеся карыстацца праграмным забеспячэннем: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (гэты інтэрактыўны дызайн працуе лепш за ўсё).
Вышэйзгаданы змест можа вырашыць як мінімум 99% праблем з распрацоўкай грунтоўкі.
Кантралюйце дэталі афармлення грунтоўкі
1. Даўжыня грунтоўкі
Агульная даўжыня грунтоўкі складае 18~30 баз.Увогуле, найбольш важным фактарам, які вызначае тэмпературу адпалу грунтоўкі, з'яўляецца даўжыня грунтоўкі.Звычайна выбіраецца тэмпература адпалу грунтоўкі (значэнне Tm -5 ℃), а некаторыя непасрэдна выкарыстоўваюць значэнне Tm.Для прыблізнага разліку тэмпературы адпалу праймераў можна выкарыстоўваць наступныя формулы.
Калі даўжыня праймера менш за 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Калі даўжыня праймера больш за 20 bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500/даўжыня -5 ℃
Акрамя таго, шмат праграмнага забеспячэння таксама можна выкарыстоўваць для разліку тэмпературы адпалу, прынцып разліку будзе іншым, таму часам разлічанае значэнне можа мець невялікі разрыў.Для аптымізацыі рэакцый ПЦР выкарыстоўваюцца самыя кароткія праймеры, якія забяспечваюць тэмпературу адпалу не ніжэй за 54 ℃ для лепшай эфектыўнасці і спецыфічнасці.
У цэлым спецыфічнасць праймера павялічваецца ў чатыры разы для кожнага дадатковага нуклеатыду, так што мінімальная даўжыня праймера для большасці прыкладанняў складае 18 нуклеатыдаў.Верхняя мяжа даўжыні праймера не вельмі важная, у асноўным звязана з эфектыўнасцю рэакцыі.З-за энтрапіі, чым даўжэй праймер, тым ніжэй хуткасць, з якой ён адпальваецца, каб звязацца з ДНК-мішэнню, каб утварыць стабільную двухцепочечную матрицу для звязвання ДНК-палімеразы.
Пры выкарыстанні праграмнага забеспячэння для распрацоўкі праймераў даўжыню праймераў можна па чарзе вызначыць па значэнні TM, асабліва для праймераў флуарэсцэнтнай колькаснай ПЦР, TM=60℃ або каля таго, трэба кантраляваць.
2.Змест GC
Як правіла, утрыманне G+C у паслядоўнасцях праймераў складае 40%~60%, і ўтрыманне GC і значэнне Tm пары праймераў павінны быць узгоднены.Калі праймер мае сур'ёзную тэндэнцыю GC або AT, адпаведную колькасць A, T або G і C хваста можна дадаць да 5'-канца праймера.
3. Тэмпература адпалу
Тэмпература адпалу павінна быць на 5 ℃ ніжэй, чым тэмпература развязкі.Калі колькасць асноў праймераў невялікая, тэмпературу адпалу можна адпаведна павялічыць, што можа павысіць спецыфічнасць ПЦР.Калі колькасць падстаў вялікая, тэмпературу адпалу можна адпаведна знізіць.Розніца тэмператур адпалу паміж парай праймераў у 4 ℃ ~ 6 ℃ не паўплывае на выхад ПЦР, але ў ідэале тэмпература адпалу пары праймераў аднолькавая і можа вар'іравацца ў межах 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Пазбягайце вобласці другаснай структуры шаблону ўзмацнення
Пры выбары ўзмоцненага фрагмента лепш пазбягаць вобласці другаснай структуры шаблону.Стабільную другасную структуру мэтавага фрагмента можна прадбачыць і ацаніць з дапамогай адпаведнага камп'ютэрнага праграмнага забеспячэння, што дапамагае пры выбары шаблону.Эксперыментальныя вынікі паказваюць, што пашырэнне часта бывае няўдалым, калі свабодная энергія (△G) вобласці, якую трэба пашырыць, складае менш за 58,6 кДж/моль.
5. Несупадзенне з ДНК-мішэнню
Калі ампліфікаваная паслядоўнасць ДНК-мішэні вялікая, праймер можа звязвацца з некалькімі часткамі ДНК-мішэні, у выніку чаго ў выніку з'яўляюцца некалькі палос.На гэты раз неабходна выкарыстоўваць тэставанне праграмнага забеспячэння BLAST, сайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Абярыце Выраўнаваць дзве паслядоўнасці (bl2seq).
Устаўка праймерных паслядоўнасцей у зону 1 і мэтавых паслядоўнасцей ДНК у зону 2 узаемазаменныя, і BLAST разлічвае камплементарныя, антысэнсавыя і іншыя магчымасці, таму карыстальнікам не трэба заўважаць, ці з'яўляюцца абодва ланцугі сэнсавымі.Вы таксама можаце ўвесці нумар GI, калі ведаеце нумар GI паслядоўнасці ў базе даных, таму вам не трэба будзе ўстаўляць вялікую частку паслядоўнасці.Нарэшце, націсніце «Выраўнаваць па 3», каб убачыць, ці мае праймер некалькі гамалагічных сайтаў у ДНК-мішэні.
6. Грунтоўка
3 'канец праймера - гэта тое месца, дзе пачынаецца пашырэнне, таму важна не дапусціць, каб несупадзенні пачыналіся там.Канец 3 'не павінен быць больш за 3 G або C запар, таму што гэта прывядзе да памылковага запуску праймера ў вобласці паслядоўнасці ўзбагачэння G+C.3'-канец не можа ўтвараць другасную структуру, за выключэннем спецыяльных рэакцый ПЦР (AS-PCR), 3'-канец праймера не можа быць неадпаведным.Напрыклад, калі вобласць кадавання ўзмацняецца, 3'-канец праймера не павінен заканчвацца ў трэцім становішчы кодона, таму што трэцяе становішча кодона схільна дэгенераваць, што паўплывае на спецыфічнасць і эфектыўнасць ампліфікацыі.Пры выкарыстанні праймераў для далучэння звярніце ўвагу на табліцу выкарыстання кодона, звярніце ўвагу на біялагічныя перавагі, не выкарыстоўвайце праймеры для далучэння на 3'-канцы і выкарыстоўвайце больш высокую канцэнтрацыю праймераў (1 мкМ-3 мкМ).
7. Другасная структура буквароў
Самі праймеры не павінны мець камплементарных паслядоўнасцей, інакш самі праймеры будуць згортвацца ў шпілечныя структуры, і гэтая другасная структура будзе ўплываць на звязванне праймераў і шаблонаў з-за стэрычных перашкод.Калі выкарыстоўваецца штучнае меркаванне, бесперапынныя камплементарныя асновы праймераў самі па сабе не павінны перавышаць 3 пн.Паміж двума праймерамі не павінна быць камплементарнасці, асабліва варта пазбягаць дадатковага перакрыцця 3'-канца, каб прадухіліць адукацыю дымераў праймераў.Увогуле, паміж парай праймераў павінна быць не больш за 4 паслядоўныя гамалогіі або камплементарнасці.
8. Дадайце маркеры або месцы
5 'канец практычна не ўплывае на спецыфічнасць ампліфікацыі і таму можа быць зменены без уплыву на спецыфічнасць ампліфікацыі.Мадыфікацыя праймера 5 'канца ўключала: даданне сайта рэстрыкцыі фермента;Пазначаны біятын, флуарэсцэнцыя, дыгаксін, Eu3+ і інш. Увядзіце паслядоўнасці ДНК, якія звязваюць бялок;Увядзенне сайтаў мутацый, устаўка і адсутнасць паслядоўнасцей мутацый і ўвядзенне паслядоўнасцей промоторов і г.д. Дадатковыя падставы ў большай ці меншай ступені паўплываюць на эфектыўнасць ампліфікацыі і павялічаць верагоднасць утварэння дымера праймера, але на наступным этапе трэба зрабіць некаторыя саступкі.Дадатковыя паслядоўнасці, якія не існуюць у паслядоўнасці-мішэні, такія як сайты рэстрыкцыі і промоторные паслядоўнасці, могуць быць дададзены да 5'-канца праймера без уплыву на спецыфічнасць.Гэтыя паслядоўнасці не ўключаны ў разлік значэнняў праймера Tm, але павінны быць правераны на камплементарнасць і ўнутраную другасную структуру.
9. Субклоны
Часцей за ўсё ПЦР - гэта толькі папярэдняе кланаванне, а потым нам трэба субкланіраваць мэтавы фрагмент у розныя вектары, таму нам трэба стварыць дадатковыя базы для наступнай аперацыі на этапе ПЦР.
Некаторыя паслядоўнасці, прызначаныя для субкланавання, прыведзены ніжэй.
Быў дададзены сайт рэстрыкцыі эндануклеазы рэстрыкцыі
Даданне сайтаў рэстрыкцыі ферментаў з'яўляецца найбольш часта выкарыстоўваным метадам субкланавання прадуктаў ПЦР.Як правіла, месца расшчаплення складае шэсць падстаў, у дадатак да 5 'канца сайта расшчаплення трэба дадаць 2 ~ 3 ахоўныя падставы.Аднак колькасць ахоўных падстаў, неабходных розным ферментам, розная.Напрыклад, SalⅠ не патрабуе ахоўнай асновы, EcoRⅤ патрабуе 1 ахоўнай асновы, NotⅠ патрабуе 2 ахоўных асновы, а Hind Ⅲ патрабуе 3 ахоўных асновы.
LIC дадае хвост
Поўная назва LIC - Ligation-Independent cloning, метад кланавання, вынайдзены Navogen спецыяльна для яго часткі вектара pET.Носьбіт pET, прыгатаваны метадам LIC, мае некамплементарныя адналанцуговыя ліпкія канцы з 12-15 падстаў, якія дапаўняюць адпаведныя ліпкія канцы мэтавага фрагмента ўстаўкі.Для мэт ампліфікацыі паслядоўнасць праймера 5' устаўленага фрагмента павінна дапаўняць вектар LIC.Экстранектная актыўнасць 3′→5′ ДНК-палімеразы Т4 можа праз кароткі час утварыць адналанцуговы ліпкі канец на ўстаўленым фрагменце.Паколькі прадукт можа быць сфармаваны толькі ў выніку ўзаемнага адпалу падрыхтаванага фрагмента ўстаўкі і вектара, гэты метад вельмі хуткі і эфектыўны, і гэта накіраванае кланаванне.
Накіраваны клон TA дадае хвост
Кланаванне ТА не змагло накіраваць фрагмент у вектар, таму пазней Invitrogen прадставіла вектар, які мог нацэльвацца на кланаванне, які ўтрымліваў чатыры прыкметныя падставы GTGGS на адным канцы.Такім чынам, пры распрацоўцы праймераў для ПЦР неабходна адпаведна дадаваць камплементарныя паслядоўнасці, каб можна было «арыентаваць» фрагменты.
Калі ў вас не хапае часу, вы можаце паспрабаваць прамы сінтэз, аб'яднаўшы ген з вектарам, што мы называем сінтэзам гена ET у даследчыкаў музеяў.
D. Метад кланавання In-Fusion
Лігаза не патрабуецца, доўгая рэакцыя не патрабуецца.Пакуль паслядоўнасць на абодвух канцах лінеарызаванага вектара ўведзена ў канструкцыю праймераў, затым прадукт ПЦР і лінеарызаваны вектар дадаюцца ў раствор фермента для зліцця, які змяшчае BSA, і змяшчаюцца пры пакаёвай тэмпературы на паўгадзіны, трансфармацыя можа быць выканана.Гэты метад асабліва падыходзіць для пераўтварэння вялікіх аб'ёмаў.
10. Зліць буквар
Часам аб распрацоўцы праймера вядома толькі абмежаваная інфармацыя аб паслядоўнасці.Напрыклад, калі вядомая толькі амінакіслотная паслядоўнасць, можна спраектаваць праймер зліцця.Праймер зліцця - гэта сумесь розных паслядоўнасцей, якія прадстаўляюць усе розныя магчымасці асноў, якія кадуюць адну амінакіслату.Каб павялічыць спецыфічнасць, вы можаце звярнуцца да табліцы выкарыстання кадонаў, каб паменшыць анексію ў адпаведнасці з перавагамі базавага выкарыстання розных арганізмаў.Гипоксантин можна спалучаць з усімі асновамі, каб знізіць тэмпературу адпалу грунтоўкі.Не выкарыстоўвайце далучаныя асновы на 3'-канцы праймера, таму што адпалу апошніх 3-х асноў на 3'-канцы дастаткова для пачатку ПЦР не ў тым месцы.Выкарыстоўваюцца больш высокія канцэнтрацыі праймераў (ад 1 мкМ да 3 мкМ), паколькі праймеры ў многіх сумесях для далучэння не з'яўляюцца спецыфічнымі для мэтавага шаблону.
ПЦР сыравіныкантроль
1. Колькасць грунтоўкі
Канцэнтрацыя кожнага праймера складае 0,1 ~ 1 мкмоль або 10 ~ 100 пмоль.Неабходны вынік лепш дамагчыся з найменшай колькасцю грунтоўкі.Высокая канцэнтрацыя праймера прывядзе да неадпаведнасці і неспецыфічнай ампліфікацыі, а таксама павялічыць верагоднасць утварэння дымераў паміж праймерамі.
2. Канцэнтрацыя грунтоўкі
Канцэнтрацыя праймераў ўплывае на спецыфічнасць.Аптымальная канцэнтрацыя праймера звычайна складае ад 0,1 да 0,5 мкМ.Больш высокія канцэнтрацыі праймераў прыводзяць да ампліфікацыі неспецыфічных прадуктаў.
3. Тэмпература адпалу грунтоўкі
Яшчэ адным важным параметрам для грунтовак з'яўляецца тэмпература плаўлення (Tm).Гэта тэмпература, калі 50% праймераў і камплементарных паслядоўнасцей прадстаўлены ў выглядзе двухцепочечных малекул ДНК.Tm патрабуецца для ўстаноўкі тэмпературы адпалу ПЦР.У ідэале тэмпература адпалу дастаткова нізкая, каб забяспечыць эфектыўны адпал праймераў з мэтавай паслядоўнасцю, але дастаткова высокая, каб паменшыць неспецыфічнае звязванне.Разумная тэмпература адпалу ад 55 ℃ да 70 ℃.Тэмпература адпалу звычайна ўсталёўваецца на 5 ℃ ніжэй, чым Tm грунтоўкі.
Існуе некалькі формул для ўстаноўкі Tm, якія моцна адрозніваюцца ў залежнасці ад выкарыстоўванай формулы і паслядоўнасці праймераў.Паколькі большасць формул забяспечвае разліковае значэнне Tm, усе тэмпературы адпалу з'яўляюцца толькі адпраўной кропкай.Спецыфічнасць можна палепшыць, аналізуючы некалькі рэакцый, якія паступова павышаюць тэмпературу адпалу.Пачніце ніжэй за разліковую Tm-5 ℃ і паступова павялічвайце тэмпературу адпалу з крокам 2 ℃.Больш высокая тэмпература адпалу паменшыць адукацыю дымераў грунтоўкі і неспецыфічных прадуктаў.Для дасягнення найлепшых вынікаў два праймеры павінны мець прыблізныя значэнні Tm.Калі розніца Tm пар праймераў больш за 5 ℃, праймеры пакажуць значны фальстарт пры выкарыстанні больш нізкай тэмпературы адпалу ў цыкле.Калі дзве праймеры Tm адрозніваюцца, усталюйце тэмпературу адпалу на 5 ℃ ніжэй, чым самая нізкая Tm.У якасці альтэрнатывы, для павышэння спецыфічнасці, спачатку можна выканаць пяць цыклаў пры тэмпературах адпалу, прызначаных для больш высокіх Tm, а затым астатнія цыклы пры тэмпературах адпалу, прызначаных для больш нізкіх Tm.Гэта дазваляе атрымаць частковую копію шаблону прызначэння ў жорсткіх умовах.
4. Чысціня і стабільнасць грунтоўкі
Стандартная чысціня спецыяльных праймераў адпавядае большасці прымянення ПЦР.Выдаленне бензаільных і изобутилильных груп шляхам абяссолвання мінімальна і, такім чынам, не перашкаджае ПЦР.Некаторыя прыкладанні патрабуюць ачысткі, каб выдаліць любыя няпоўныя паслядоўнасці ў працэсе сінтэзу.Гэтыя ўсечаныя паслядоўнасці ўзнікаюць таму, што эфектыўнасць хімічнага сінтэзу ДНК не складае 100%.Гэта кругавы працэс, які выкарыстоўвае паўторныя хімічныя рэакцыі, калі кожная аснова дадаецца для стварэння ДНК ад 3' да 5'.Вы можаце пацярпець няўдачу ў любым цыкле.Больш доўгія праймеры, асабліва больш за 50 асноў, маюць вялікую долю ўсечаных паслядоўнасцей і могуць патрабаваць ачысткі.
Выхад праймераў залежыць ад эфектыўнасці сінтэтычнай хіміі і метаду ачысткі.Біяфармацэўтычныя кампаніі, такія як Cytology і Shengong, усе выкарыстоўваюць мінімальную адзінку OD, каб забяспечыць агульны выхад алігануклеазідаў.Праймеры на заказ пастаўляюцца ў выглядзе сухога парашка.Лепш за ўсё паўторна растварыць праймеры ў TE, каб канчатковая канцэнтрацыя была 100 мкМ.TE лепш, чым дэіянізаваная вада, таму што pH вады часта бывае кіслым і выклікае гідроліз алігануклеазідаў.
Ўстойлівасць грунтовак залежыць ад умоў захоўвання.Сухі парашок і раствораныя грунтоўкі варта захоўваць пры -20 ℃.Праймеры, раствораныя ў TE ў канцэнтрацыях больш за 10 мкМ, можна стабільна захоўваць пры -20 ℃ на працягу 6 месяцаў, але можна захоўваць толькі пры пакаёвай тэмпературы (ад 15 ℃ да 30 ℃) менш за 1 тыдзень.Сухія парашковыя грунтоўкі можна захоўваць пры -20 C не менш за 1 год і пры пакаёвай тэмпературы (ад 15 C да 30 C) да 2 месяцаў.
5. Ферменты і іх канцэнтрацыі
У цяперашні час выкарыстоўваная ДНК-палімераза Taq у асноўным з'яўляецца генна-інжынерным ферментам, які сінтэзуецца бактэрыямі палачкі.Колькасць фермента, неабходнага для каталізацыі тыповай рэакцыі ПЦР, складае каля 2,5 ЕД (адносіцца да агульнага аб'ёму рэакцыі 100 мкл).Калі канцэнтрацыя занадта высокая, гэта можа прывесці да неспецыфічнага ўзмацнення;калі канцэнтрацыя занадта нізкая, колькасць сінтэтычнага прадукту будзе зніжана.
6. Якасць і канцэнтрацыя дНТФ
Якасць dNTP цесна звязана з канцэнтрацыяй і эфектыўнасцю ПЦР-ампліфікацыі.Парашок dNTP грануляваны, і яго зменлівасць губляе біялагічную актыўнасць пры няправільным захоўванні.Раствор dNTP з'яўляецца кіслым і павінен выкарыстоўвацца ў высокай канцэнтрацыі з 1 М NaOH або 1 М буферным растворам Tris.HCL, каб адрэгуляваць яго PH да 7,0 ~ 7,5, невялікая колькасць дадатковай упакоўкі, захоўванне ў замарожаным выглядзе пры -20 ℃.Шматразовае замарожванне-адтаванне пагоршыць dNTP.У рэакцыі ПЦР dNTP павінен быць 50 ~ 200 мкмоль/л.Асабліва трэба звярнуць увагу на тое, каб канцэнтрацыя чатырох ДНТПС была аднолькавай (роўны мольны прэпарат).Калі канцэнтрацыя любога з іх адрозніваецца ад іншых (вышэй або ніжэй), будзе выклікана неадпаведнасць.Занадта нізкая канцэнтрацыя знізіць выхад прадуктаў ПЦР.dNTP можа злучацца з Mg2+ і зніжаць канцэнтрацыю вольнага Mg2+.
7. Матрычная (ген-мішэнь) нуклеінавая кіслата
Колькасць і ступень ачысткі матрычнай нуклеінавай кіслаты з'яўляецца адным з ключавых звёнаў для поспеху або няўдачы ПЦР.Традыцыйныя метады ачысткі ДНК звычайна выкарыстоўваюць SDS і пратэазу K для пераварвання і ўтылізацыі узораў.Асноўныя функцыі SDS: раствараць ліпіды і вавёркі на клеткавай мембране, такім чынам разбураючы клеткавую мембрану шляхам растварэння мембранных бялкоў, і раз'ядноўваць ядзерныя вавёркі ў клетцы, SDS таксама можа спалучацца з вавёркамі і выпадаць у асадак;Пратэаза K можа гідралізаваць і пераварваць вавёркі, асабліва гістоны, звязаныя з ДНК, а затым выкарыстоўваць арганічны растваральнік фенол і хлараформ для экстракцыі бялкоў і іншых кампанентаў клеткі, а таксама выкарыстоўваць этанол або ізапрапілавы спірт для аблогі нуклеінавай кіслаты.Вынятую нуклеінавую кіслату можна выкарыстоўваць у якасці матрыцы для рэакцый ПЦР.Для агульных клінічных узораў для выяўлення можна выкарыстоўваць хуткі і просты метад для растварэння клетак, лізавання патагенаў, расшчаплення і выдалення бялкоў з храмасом у вызваленне генаў-мішэняў і непасрэднага выкарыстання для ПЦР-ампліфікацыі.Для экстракцыі матрыцы РНК звычайна выкарыстоўваецца метад гуанідынізатыяцыянату або пратэазы K, каб прадухіліць дэградацыю РНКазы.
8. Канцэнтрацыя Mg2+
Mg2+ аказвае істотны ўплыў на спецыфічнасць і вынік ПЦР-ампліфікацыі.У агульнай рэакцыі ПЦР, калі канцэнтрацыя розных dNTP складае 200 мкмоль/л, адпаведная канцэнтрацыя Mg2+ складае 1,5 ~ 2,0 ммоль/л.Канцэнтрацыя Mg2+ занадта высокая, спецыфічнасць рэакцыі зніжаецца, адбываецца неспецыфічнае ўзмацненне, занадта нізкая канцэнтрацыя прывядзе да зніжэння актыўнасці ДНК-палімеразы Taq, што прывядзе да зніжэння колькасці прадуктаў рэакцыі.
Іёны магнію ўплываюць на некалькі аспектаў ПЦР, такіх як актыўнасць ДНК-палімеразы, якая ўплывае на ўраджайнасць;Іншы прыклад - адпал грунтоўкі, які ўплывае на спецыфічнасць.dNTP і шаблон звязваюцца з іёнам магнію, памяншаючы колькасць вольнага іёна магнію, неабходнага для актыўнасці фермента.Аптымальная канцэнтрацыя іёнаў магнію адрозніваецца для розных пар праймераў і шаблонаў, але тыповая пачатковая канцэнтрацыя ПЦР з 200 мкМ dNTP складае 1,5 мМ (заўвага: для колькаснай ПЦР у рэальным часе выкарыстоўвайце ад 3 да 5 мМ раствор іёнаў магнію з флуоресцентным зондам).Больш высокія канцэнтрацыі свабодных іёнаў магнію павялічваюць выхад, але таксама павялічваюць неспецыфічнае ўзмацненне і зніжаюць дакладнасць.Каб вызначыць аптымальную канцэнтрацыю, тытраванне іёнаў магнію праводзілі з крокам 0,5 мм ад 1 мм да 3 мм.Каб паменшыць залежнасць ад аптымізацыі іёнаў магнію, можна выкарыстоўваць ДНК-палімеразу Platinum Taq.ДНК-палімераза Platinum Taq здольная падтрымліваць функцыю ў больш шырокім дыяпазоне канцэнтрацый іёнаў магнію, чым ДНК-палімераза Taq, і таму патрабуе менш аптымізацыі.
9. ПЦР-прамотуючыя дабаўкі
Аптымізацыі тэмпературы адпалу, канструкцыі грунтоўкі і канцэнтрацыі іёнаў магнію дастаткова для высокаспецыфічнай ампліфікацыі большасці шаблонаў;аднак некаторыя шаблоны, у тым ліку з высокім утрыманнем GC, патрабуюць дадатковых мер.Дабаўкі, якія ўплываюць на тэмпературу плаўлення ДНК, забяспечваюць яшчэ адзін спосаб палепшыць спецыфічнасць прадукту і ўраджайнасць.Для дасягнення найлепшых вынікаў патрабуецца поўная дэнатурацыя шаблону.
Акрамя таго, другасная структура прадухіляе звязванне праймера і падаўжэнне фермента.
ПЦР-дабаўкі, у тым ліку фармамід, ДМСО, гліцэрына, бэтаін і PCRx Enhancer Solution, узмацняюць ампліфікацыю.Іх магчымы механізм заключаецца ў зніжэнні тэмпературы плаўлення, такім чынам дапамагаючы адпалу праймераў і спрыяючы пашырэнню ДНК-палімеразы праз вобласць другаснай структуры.PCRx Solution мае і іншыя перавагі.Патрабуецца мінімальная аптымізацыя іёнаў магнію пры выкарыстанні з ДНК-палімеразай Platinum Taq і ДНК-палімеразай Platinum Pfx.Такім чынам, тэхніка Platinum спалучаецца з дадаткам для павышэння спецыфічнасці пры памяншэнні залежнасці ад трэцяга падыходу, аптымізацыі іёнаў магнію.Для дасягнення найлепшых вынікаў варта аптымізаваць канцэнтрацыю дабавак, асабліва ДМСО, фармамід і гліцэрына, якія інгібіруюць ДНК-палімеразу Taq.
10. Гарачы старт
ПЦР з гарачым стартам з'яўляецца адным з найважнейшых метадаў павышэння спецыфічнасці ПЦР у дадатак да добрай распрацоўкі грунтоўкі.Хоць аптымальная тэмпература элангацыі Taq ДНК-палімеразы складае 72 ℃, палімераза застаецца актыўнай пры пакаёвай тэмпературы.Такім чынам, неспецыфічныя прадукты ўтвараюцца, калі тэмпература вытрымкі ніжэй тэмпературы адпалу падчас падрыхтоўкі рэакцыі ПЦР і ў пачатку тэрмічнага цыклу.Пасля адукацыі гэтыя неспецыфічныя прадукты эфектыўна ўзмацняюцца.ПЦР з гарачым стартам асабліва эфектыўная, калі ўчасткі, якія выкарыстоўваюцца для распрацоўкі праймераў, абмежаваныя размяшчэннем генетычных элементаў, такіх як сайт-накіраваныя мутацыі, кланаванне экспрэсіі або канструяванне і маніпуляцыі з генетычнымі элементамі, якія выкарыстоўваюцца для распрацоўкі ДНК.
Распаўсюджаным метадам абмежавання актыўнасці ДНК-палімеразы Taq з'яўляецца падрыхтоўка рэакцыйнага раствора ПЦР на лёдзе і змяшчэнне яго ў папярэдне разагрэты ПЦР-апарат.Гэты метад просты і недарагі, але ён не завяршае дзейнасць фермента і, такім чынам, не цалкам выключае ўзмацненне неспецыфічных прадуктаў.
Тэрмічнае праймінг затрымлівае сінтэз ДНК шляхам інгібіравання важнага кампанента, пакуль ПЦР-апарат не дасягне тэмпературы дэнатурацыі.Большасць ручных метадаў тэрмічнага ініцыявання, уключаючы адкладзенае даданне ДНК-палімеразы Taq, з'яўляюцца грувасткімі, асабліва для прымянення з высокай прапускной здольнасцю.Іншыя метады тэрмічнага праймінгавання выкарыстоўваюць васковы шчыт для заключэння істотнага кампанента, у тым ліку іёнаў магнію або ферментаў, або для фізічнай ізаляцыі рэактыўных кампанентаў, такіх як шаблоны і буферы.Падчас тэрмічнага цыклу розныя кампаненты вылучаюцца і змешваюцца разам, калі воск плавіцца.Як і метад ручнога гарачага пуску, метад васковага экрана з'яўляецца грувасткім і схільным да забруджванняў і не падыходзіць для прымянення з высокай прапускной здольнасцю.
Плацінавая ДНК-палімераза зручная і эфектыўная для аўтаматычнай ПЦР з гарачым стартам.ДНК-палімераза Platinum Taq складаецца з рэкамбінантнай ДНК-палімеразы Taq у спалучэнні з моноклональными антыцеламі супраць ДНК-палімеразы Taq.Антыцелы фармулююцца з дапамогай ПЦР для інгібіравання актыўнасці ферментаў падчас працяглага вытрымлівання тэмпературы.ДНК-палімераза Taq была выпушчана ў рэакцыю падчас ізаляцыі пры 94 ℃ на этапе дэнатурацыі, аднаўляючы поўную актыўнасць палімеразы.У адрозненне ад хімічна мадыфікаванай Taq ДНК-палімеразы для тэрмічнай ініцыяцыі, плацінавы фермент не патрабуе працяглай ізаляцыі пры 94℃ (ад 10 да 15 хвілін) для актывацыі палімеразы.З дапамогай ДНК-палімеразы PlatinumTaq 90% актыўнасці ДНК-палімеразы Taq аднаўлялася праз 2 хвіліны пры 94 ℃.
11. Гняздо-ПЦР
Паслядоўныя раунды ампліфікацыі з выкарыстаннем укладзеных праймераў могуць палепшыць спецыфічнасць і адчувальнасць.Першы раунд - гэта стандартнае ўзмацненне ад 15 да 20 цыклаў.Невялікая частка першапачатковага прадукту ампліфікацыі была разведзена ў 100-1000 разоў і дададзена ў другі раунд ампліфікацыі на працягу 15-20 цыклаў.У якасці альтэрнатывы, пачатковы ўзмоцнены прадукт можна вызначыць памерам шляхам ачысткі геля.У другім раундзе ампліфікацыі выкарыстоўваецца ўкладзены праймер, які можа звязвацца з паслядоўнасцю-мішэнню ўнутры першага праймера.Выкарыстанне ўкладзенай ПЦР памяншае магчымасць ампліфікацыі некалькіх сайтаў-мішэняў, таму што ёсць некалькі паслядоўнасцей-мішэняў, камплементарных абодвум наборам праймераў.Аднолькавая агульная колькасць цыклаў (ад 30 да 40) з тымі ж праймерамі амплифицировала неспецыфічныя сайты.Укладзеная ПЦР павышае адчувальнасць абмежаваных мэтавых паслядоўнасцей (напрыклад, рэдкіх мРНК) і паляпшае спецыфічнасць складанай ПЦР (напрыклад, 5′ RACE).
12. Сыходная ПЦР
Сыходная ПЦР паляпшае спецыфічнасць за кошт выкарыстання жорсткіх умоў адпалу на працягу першых некалькіх цыклаў ПЦР.Цыкл пачынаецца пры тэмпературы адпалу, якая прыкладна на 5 ℃ вышэй, чым меркаваная Tm, затым кожны цыкл зніжаецца на 1-2 ℃, пакуль тэмпература адпалу не стане ніжэй за Tm 5 ℃.Будзе пашыраны толькі шаблон прызначэння з самай высокай гамалогіяй.Гэтыя прадукты працягваюць пашырацца ў наступных цыклах, выцясняючы узмоцненыя неспецыфічныя прадукты.Сыходная ПЦР карысная для метадаў, дзе невядомая ступень гамолагі паміж праймерам і мэтавай матрыцай, напрыклад для дактыласкапіі AFLP ДНК.
Звязаныя наборы ПЦР
Герой ПЦР 2×TMСістэма Mix мае больш высокую талерантнасць да інгібітараў ПЦР, чым звычайная сістэма ПЦР Mix, і можа лёгка справіцца з ПЦР-ампліфікацыяй розных складаных шаблонаў.Унікальная сістэма рэакцыі і высокаэфектыўны Taq Hero робяць рэакцыю ПЦР больш высокай эфектыўнасцю ампліфікацыі, спецыфічнасцю і адчувальнасцю.
Больш высокая эфектыўнасць узмацнення
Ён мае 5'→3' ДНК-палімеразную актыўнасць і 5'→3' экзануклеазную актыўнасць, без 3'→5' экзануклеазнай актыўнасці.
ПЦР у рэальным часе Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Спецыфічны - аптымізаваны буфер і фермент Taq з гарачым стартам могуць прадухіліць неспецыфічную ампліфікацыю і адукацыю дымера праймера
Высокая адчувальнасць - можа выяўляць нізкія копіі шаблону
У наборы выкарыстоўваецца унікальны рэагент для зваротнай транскрыпцыі Foregene і ДНК-палімераза Foregene HotStar Taq у спалучэнні з унікальнай рэакцыйнай сістэмай для эфектыўнага павышэння эфектыўнасці ампліфікацыі і спецыфічнасці рэакцыі.
Час размяшчэння: 9 мая 2023 г
