• ПЦР - гэта метад, які выкарыстоўваецца для ампліфікацыі ДНК з невялікай колькасці шаблону ДНК.RT-PCR выкарыстоўвае зваротную транскрыпцыю для атрымання шаблону ДНК з крыніцы РНК, які затым можна ўзмацніць.
• ПЦР і ОТ-ПЦР звычайна з'яўляюцца канчатковымі рэакцыямі, у той час як кПЦР і ОТ-кПЦР выкарыстоўваюць кінэтыку хуткасці сінтэзу прадукту падчас рэакцыі ПЦР для колькаснага вызначэння колькасці прысутнай матрыцы.
• Новыя метады, такія як лічбавая ПЦР, забяспечваюць абсалютную колькасную ацэнку зыходнай ДНК-матрыцы, у той час як такія метады, як ізатэрмічная ПЦР, зніжаюць патрэбу ў дарагім абсталяванні для атрымання надзейных вынікаў.

Палімеразная ланцуговая рэакцыя (ПЦР) - гэта адносна просты і шырока выкарыстоўваны метад малекулярнай біялогіі для ампліфікацыі і выяўлення паслядоўнасцей ДНК і РНК.У параўнанні з традыцыйнымі метадамі кланавання і ампліфікацыі ДНК, якія часта могуць заняць некалькі дзён, ПЦР патрабуе ўсяго некалькіх гадзін.ПЦР вельмі адчувальная і патрабуе мінімальнага шаблону для выяўлення і ампліфікацыі пэўных паслядоўнасцей.Базавыя метады ПЦР прасунуліся далей ад простага выяўлення ДНК і РНК.Ніжэй мы прадставілі агляд розных метадаў ПЦР і рэагентаў, якія мы прапануем Enzo Life Sciences для вашых даследчых патрэб.Мы імкнемся дапамагчы навукоўцам хутка атрымаць доступ да ПЦР-рэагентаў для выкарыстання ў наступным даследчым праекце!

ПЦР

Для стандартнай ПЦР усё, што вам спатрэбіцца, гэта ДНК-палімераза, магній, нуклеатыды, праймеры, шаблон ДНК для ампліфікацыі і тэрмацыклер.Механізм ПЦР такі ж просты, як і яго прызначэнне: 1) двухцепочечная ДНК (dsDNA) падвяргаецца цеплавой дэнатурацыі, 2) праймеры выраўноўваюцца да адзінкавых ланцугоў ДНК і 3) праймеры падаўжаюцца ДНК-палімеразай, у выніку чаго ўтвараюцца дзве копіі зыходны ланцуг ДНК.Працэс дэнатурацыі, адпалу і падаўжэння на працягу серыі тэмператур і часу вядомы як адзін цыкл узмацнення (мал. 1).

Кожны этап цыкла павінен быць аптымізаваны для шаблону і набору праймераў, якія выкарыстоўваюцца.Гэты цыкл паўтараецца прыкладна 20-40 разоў, і затым узмоцнены прадукт можа быць прааналізаваны, як правіла, з дапамогай агарозного геля (мал. 2).

Паколькі ПЦР з'яўляецца вельмі адчувальным метадам і для адной рэакцыі патрабуюцца вельмі малыя аб'ёмы, рэкамендуецца прыгатаваць майстар-мікс для некалькіх рэакцый.Майстар-мікс трэба добра змяшаць, а затым падзяліць на колькасць рэакцый, гарантуючы, што кожная рэакцыя будзе ўтрымліваць аднолькавую колькасць фермента, dNTP і праймераў.Многія пастаўшчыкі, такія як Enzo Life Sciences, таксама прапануюць сумесі ПЦР, якія ўжо ўтрымліваюць усё, акрамя праймераў і шаблону ДНК.

Вобласці, багатыя гуанінам/цытазінам (багатыя GC), уяўляюць сабой праблему ў стандартных метадах ПЦР.Паслядоўнасці, багатыя GC, больш стабільныя, чым паслядоўнасці з меншым утрыманнем GC.Акрамя таго, паслядоўнасці, багатыя GC, маюць тэндэнцыю ўтвараць другасныя структуры, такія як шпількі.У выніку двайныя ланцугі, багатыя GC, цяжка цалкам аддзяліць падчас фазы дэнатурацыі.Такім чынам, ДНК-палімераза не можа бесперашкодна сінтэзаваць новы ланцуг.Больш высокая тэмпература дэнатурацыі можа палепшыць гэта, а карэкціроўка ў бок больш высокай тэмпературы адпалу і меншага часу адпалу можа прадухіліць неспецыфічнае звязванне праймераў, багатых GC.Дадатковыя рэагенты могуць узмацніць ампліфікацыю GC-багатых паслядоўнасцей.ДМСО, гліцэрына і бэтаін дапамагаюць разбурыць другасныя структуры, выкліканыя ўзаемадзеяннем GC, і тым самым палягчаюць аддзяленне падвойных нітак.

ПЦР з гарачым стартам

Неспецыфічная ампліфікацыя - праблема, якая можа ўзнікнуць падчас ПЦР.Большасць ДНК-палімераз, якія выкарыстоўваюцца для ПЦР, лепш за ўсё працуюць пры тэмпературы ад 68°C да 72°C.Аднак фермент можа быць актыўным і пры больш нізкіх тэмпературах, хоць і ў меншай ступені.Пры тэмпературах, значна ніжэйшых за тэмпературу адпалу, праймеры могуць звязвацца неспецыфічна і прыводзіць да неспецыфічнага ўзмацнення, нават калі рэакцыя праводзіцца на лёдзе.Гэтага можна прадухіліць, выкарыстоўваючы інгібітары палімеразы, якія аддзяляюць ад ДНК-палімеразы толькі пры дасягненні пэўнай тэмпературы, адсюль і тэрмін ПЦР з гарачым стартам.Інгібітарам можа быць антыцела, якое звязвае палімеразу і дэнатуруе пры пачатковай тэмпературы дэнатурацыі (звычайна 95°C).

Палімераза высокай дакладнасці

У той час як ДНК-палімеразы ўзмацняюцца даволі дакладна да зыходнай паслядоўнасці шаблону, могуць узнікнуць памылкі ў супастаўленні нуклеатыдаў.Неадпаведнасці ў такіх прыкладаннях, як кланаванне, могуць прывесці да ўсечаных стэнаграм і няправільнай трансляцыі або неактыўных бялкоў унізе.Каб пазбегнуць гэтых неадпаведнасцяў, палімеразы з функцыяй «вычытвання» былі вызначаны і ўключаны ў працоўны працэс.Першая карэктарская палімераза, Pfu, была ідэнтыфікавана ў 1991 годзе ў Pyrococcus furiosus.Гэты фермент Pfu мае экзануклеазную актыўнасць ад 3' да 5'.Па меры ампліфікацыі ДНК экзануклеаза выдаляе неадпаведныя нуклеатыды на 3'-канцы ланцуга.Затым правільны нуклеатыд замяняецца, і сінтэз ДНК працягваецца.Ідэнтыфікацыя няправільных нуклеатыдных паслядоўнасцей заснавана на сродстве звязвання правільнага нуклеазідтрыфасфату з ферментам, дзе неэфектыўнае звязванне запавольвае сінтэз і дазваляе правесці правільную замену.Карэктурная актыўнасць палімеразы Pfu прыводзіць да меншай колькасці памылак у канчатковай паслядоўнасці ў параўнанні з ДНК-палімеразай Taq.У апошнія гады былі ідэнтыфікаваныя іншыя карэктурныя ферменты, а таксама былі зроблены мадыфікацыі зыходнага фермента Pfu для далейшага зніжэння частаты памылак падчас ампліфікацыі ДНК.

RT-PCR

ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй, або RT-PCR, дазваляе выкарыстоўваць РНК у якасці шаблону.Дадатковы этап дазваляе выяўляць і ўзмацняць РНК.РНК адваротна транскрыбуецца ў камплементарную ДНК (кДНК) з дапамогай зваротнай транскрыптазы.Якасць і чысціня матрыцы РНК важныя для поспеху RT-PCR.Першым этапам RT-PCR з'яўляецца сінтэз гібрыда ДНК/РНК.Зваротная транскрыптаза таксама мае функцыю РНКазы Н, якая разбурае частку РНК гібрыда.Затым адналанцуговая малекула ДНК дабудоўваецца з дапамогай ДНК-залежнай ДНК-палімеразнай актыўнасці зваротнай транскрыптазы ў кДНК.Эфектыўнасць рэакцыі першай ніткі можа ўплываць на працэс ампліфікацыі.З гэтага моманту для ампліфікацыі кДНК выкарыстоўваецца стандартная працэдура ПЦР.Магчымасць вярнуць РНК у кДНК з дапамогай RT-PCR мае шмат пераваг, і яна ў асноўным выкарыстоўваецца для аналізу экспрэсіі генаў.РНК адналанцуговая і вельмі нестабільная, што робіць працу з ёй складанай.Звычайна гэта з'яўляецца першым этапам КПЦР, які вызначае колькасць транскрыптаў РНК у біялагічным узоры.

кПЦР і ОТ-кПЦР

Колькасная ПЦР (кПЦР) выкарыстоўваецца для выяўлення, характарыстыкі і колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот для шматлікіх ужыванняў.У RT-qPCR транскрыпты РНК часта вызначаюцца колькасна шляхам іх адваротнай транскрыпцыі ў кДНК, як апісана вышэй, а затым пасля гэтага выконваецца qPCR.Як і ў стандартнай ПЦР, ДНК узмацняецца шляхам трох паўтаральных этапаў: дэнатурацыі, адпалу і элангацыі.Аднак у кПЦР флуарэсцэнтная маркіроўка дазваляе збіраць даныя па ходзе ПЦР.Гэты метад мае шмат пераваг з-за дыяпазону даступных метадаў і хімікатаў.

У qPCR на аснове фарбавальніка (звычайна зялёнага) флуарэсцэнтная маркіроўка дазваляе колькасна вызначыць ампліфікаваныя малекулы ДНК з дапамогай фарбавальніка, які звязвае дцДНК.Падчас кожнага цыклу вымяраецца флуарэсцэнцыя.Сігнал флуарэсцэнцыі ўзрастае прапарцыйна колькасці рэплікаванай ДНК.Такім чынам, ДНК колькасна вызначаецца ў «рэальным часе» (мал. 3).Недахопы кПЦР на аснове фарбавальніка заключаюцца ў тым, што адначасова можна даследаваць толькі адну мішэнь і што фарбавальнік звязваецца з любой ds-ДНК, якая прысутнічае ва ўзоры.

У кПЦР на аснове зонда шмат мішэняў можна выявіць адначасова ў кожным узоры, але гэта патрабуе аптымізацыі і распрацоўкі зонда(-аў), арыентаванага на цэль, які выкарыстоўваецца ў дадатак да праймераў.Даступна некалькі тыпаў канструкцый зондаў, але найбольш распаўсюджаным тыпам з'яўляецца гідролізны зонд, які змяшчае флюарафор і гасільнік.Флуарэсцэнтны рэзанансны перанос энергіі (FRET) прадухіляе выпраменьванне флюарафора праз тушыцель, пакуль зонд непашкоджаны.Аднак падчас рэакцыі ПЦР зонд гідролізуецца падчас падаўжэння праймера і ампліфікацыі спецыфічнай паслядоўнасці, з якой ён звязаны.Расшчапленне зонда аддзяляе флюарафор ад гасільніка і прыводзіць да залежнага ад ампліфікацыі павелічэння флуарэсцэнцыі (мал. 4).Такім чынам, сігнал флуарэсцэнцыі ад рэакцыі кПЦР на аснове зонда прапарцыйны колькасці мэтавай паслядоўнасці зонда, якая прысутнічае ва ўзоры.Паколькі кПЦР на аснове зонда больш спецыфічная, чым кПЦР на аснове фарбавальніка, гэта тэхналогія часта выкарыстоўваецца ў дыягнастычных аналізах на аснове кПЦР.

Ізатэрмічнае ўзмацненне

Згаданыя вышэй метады ПЦР патрабуюць дарагога тэрмацыклічнага абсталявання для дакладнага павышэння і паніжэння тэмпературы ў камеры для этапаў дэнатурацыі, адпалу і пашырэння.Былі распрацаваны шэраг метадаў, якія не патрабуюць такіх дакладных прылад і могуць быць выкананы ў простай вадзяной лазні або нават у клетках, якія цікавяць.Гэтыя метады разам называюцца ізатэрмічным узмацненнем і працуюць на аснове экспанентнага, лінейнага або каскаднага ўзмацнення.

Самы вядомы тып ізатэрмічнага ўзмацнення - гэта ізатэрмічнае ўзмацненне, апасродкаванае пятлёй, або LAMP.LAMP выкарыстоўвае экспанентнае ўзмацненне пры 65⁰C для ампліфікацыі матрычнай ДНК або РНК.Пры выкананні LAMP ад чатырох да шасці праймераў, камплементарных абласцям ДНК-мішэні, выкарыстоўваюцца з ДНК-палімеразай для сінтэзу новай ДНК.Два з гэтых праймераў маюць камплементарныя паслядоўнасці, якія распазнаюць паслядоўнасці ў іншых праймерах і звязваюць іх, дазваляючы ўтварыць структуру «пятлі» ў нядаўна сінтэзаванай ДНК, якая затым дапамагае адпалу праймераў у наступных раундах ампліфікацыі.LAMP можна візуалізаваць рознымі метадамі, уключаючы флуарэсцэнцыю, электрафарэз у агарозным гелі або каларыметрыю.Лёгкасць візуалізацыі і выяўлення прысутнасці або адсутнасці прадукту з дапамогай каларыметрыі і адсутнасць неабходнага дарагога абсталявання зрабілі LAMP прыдатным варыянтам для тэставання на SARS-CoV-2 у раёнах, дзе клінічныя лабараторныя даследаванні былі недаступныя, або для захоўвання і транспарціроўкі ўзораў было немагчыма, або ў лабараторыях, якія раней не мелі тэрмацыклічнага абсталявання ПЦР.