Парады па паляпшэнню аднаўлення клею

1. Павялічце загрузку ўзору падчас электрафарэзу.

2. Выкарыстоўвайце свежэпрыготаўленный буфер для электрафарэзу.

3. Пры рэзцы клею старайцеся рэзаць толькі клей палоскамі, каб паменшыць аб'ём рэзкі клею: не патрэбны клей з невялікай колькасцю фрагментаў, інакш гэта паўплывае на хуткасць аднаўлення.

4. Расплавіўшы два ці больш кавалкі клею, выкарыстоўвайце прабірку незалежна ад таго, наколькі вялікі аб’ём, і перанясіце яе ў тую ж калонку.

5. Раствор, дададзены ў золь, можа быць трохі больш, што больш спрыяе звязванню ДНК з мембранай, але звычайна не перавышае 750 мкл.

6. Ключ да аднаўлення геля заключаецца ў звязванні ДНК з калонкай праз канцэнтрацыю солі, кіслотнасць (зарад) і гідрафобнасць раствора ў калонцы.Такім чынам, калі pH буфера для электрафарэзу занадта высокі, у золь можна дадаць 10 мкл (pH 5,0, 3 моль/л NaAC);каб лепш перахопліваць малекулы ДНК на мембране, пасля растварэння клею ў вадкасць можна дадаць для нагрэву 30% ізапрапанол.

7. Перад даданнем элюента пакіньце калонку пры пакаёвай тэмпературы на некалькі хвілін (каля 10 хвілін), каб цалкам выпарыцца этанол.

8. Нарэшце, дадайце менш элюента, каб мінімізаваць аб'ём аднаўлення.Як правіла, для элюцыі выкарыстоўваецца 30-50 мкл элюента (не занадта мала, інакш ён не зможа намачыць мембрану, што не спрыяе элюцыі);элюіраваныя кроплі знаходзяцца ў цэнтры мембраны, каб цалкам вылучыць ДНК, злучаную з мембранай.

9. Пасля дадання элюента яго можна элюіраваць на вадзяной лазні пры тэмпературы 55 градусаў на працягу 5 хвілін або змясціць у вадзяную лазню пры тэмпературы 50 градусаў больш чым на 10 хвілін, або зачыніць парафільмам пры тэмпературы 4 градусы на ноч, а затым цэнтрыфугаваць для аднаўлення на наступны дзень, эфект добры.

10. Дадайце адцэнтрыфугаваны элюат назад у адсорбцыйную калонку і зноў адцэнтрыфугуйце.

Падрабязныя метады і працэдуры выдзялення прадукту ПЦР

1. Звычайная перапрацоўка гумы

Калі вы хочаце аднавіць клей, лепш за ўсё выкарыстоўваць набор, які зручны і мае некалькі больш высокі ўзровень аднаўлення.Калі вам сапраўды трэба аднавіць яго ўручную, вы можаце дадаць 3-кратны аб'ём TE пасля разразання клею.Пасля расплаўлення на вадзяной лазні фенол, фенол/хлараформ чыста экстрагуюць, а этанол выпадае ў асадак.Вось і ўсё.

2. Аднаўленне ДНК з геляў з нізкай тэмпературай плаўлення

Ачыстка фрагментаў ДНК. Дадайце TE (10 ммоль/л Tris-HCl pH8,0, 0,1 ммоль/л EDTA), роўны аб'ёму геля, і пастаўце на вадзяную лазню пры 65°C на 5 хвілін для поўнага растварэння геля.

Пасля давядзення да пакаёвай тэмпературы дадаюць роўную колькасць фенолу (насычанага TE, TE запячатваюць у верхні пласт, а ніжні слой фенолу выдаляюць), сумесь акуратна змешваюць (змешванне не патрабуецца) і цэнтрыфугуюць пры 12 000 абаротаў у хвіліну на працягу 3 хвілін.Паўтарыць 1-2 разы.

Вазьміце супернатант, дадайце 0,1 аб'ёму 3 моль/л ацэтату натрыю (pH 5,2) і 2,5-кратны аб'ём абсалютнага этанолу, каб правесці асаджэнне этанолам.Растварыце вычышчаную ДНК з адпаведнай колькасцю TE, вымерайце ўтрыманне і падрыхтуйце да выкарыстання (яе можна выкарыстоўваць для аналізу структуры гена-мішэні, падрыхтоўкі зонда і г.д.).

3. ПЦР-аднаўленне з добрай спецыфічнасцю ампліфікацыі

Калі спецыфічнасць ПЦР-ампліфікацыі добрая, гэта простая ачыстка і аднаўленне прадукту ПЦР.Вы можаце дадаць 50 мкг/мл пратэіназы K да прадукту ПЦР, 37 градусаў на працягу 1 гадзіны, экстрагаваць адзін раз фенолам/хлараформам, экстрагаваць адзін раз хлараформам і дадаць 0,1 аб'ёму супернатанта.Ацэтат натрыю аднаўлялі асаджэннем 2,5 аб'ёмамі абсалютнага этанолу.

Спадарожныя тавары:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/