Ⅰ. Павышаюць адчувальнасць рэакцыйнай сістэмы:
1. Асобная высакаякасная РНК:
Паспяховы сінтэз кДНК адбываецца з высакаякаснай РНК.Высокая якасць РНК павінна забяспечваць, па меншай меры, агульнае даўжэй і не ўтрымлівае інгібітараў, якія не ўтрымліваюць запісваюць ферменты, такія як EDTA або SDS.Якасць РНК вызначае максімальнае значэнне інфармацыі аб паслядоўнасці, якую вы можаце перапісаць у кДНК.Агульны метад ачысткі РНК - гэта паэтапны метад выкарыстання ізацыянатаў/ацыдафенолу.Каб прадухіліць забруджванне РНКазой, РНК, аддзеленая ад багатага РНКазой ўзору (напрыклад, падстраўнікавай залозы), патрабуе захоўвання фармальдэгіду для захавання высакаякаснай РНК, што яшчэ больш важна для доўгатэрміновага захоўвання.РНК, вынятая з печані пацукі, у асноўным дэградавала пасля аднаго тыдня захоўвання ў вадзе, у той час як РНК, вынятая з селязёнкі пацукі, заставалася стабільнай пасля трох гадоў захоўвання ў вадзе.Акрамя таго, стэнаграмы памерам больш за 4 кб больш адчувальныя да дэградацыі слядоў РНКазы, чым невялікія стэнаграмы.Каб павысіць стабільнасць узору РНК для захоўвання, РНК можна растварыць у іённым металаміне і захоўваць пры -70 °C.Тылід, які выкарыстоўваецца для захавання РНК, не павінен утрымліваць розныя аб'екты, якія пагаршаюць РНК.РНК, якая атрымліваецца з падстраўнікавай залозы, можа захоўвацца ў металамаміне не менш за год.Калі вы будзеце гатовыя выкарыстоўваць РНК, вы можаце выкарыстоўваць наступныя метады для асаджэння РНК: дадайце NaCl да 0,2 мл і ў 4 разы больш этанолу, пастаўце на пакаёвую тэмпературу на 3-5 хвілін і на 5 хвілін у цэнтрыфугу 10 000 × g.
2. Выкарыстоўвайце зваротную транскрыптазу без актыўнасці РНКазы (RNaseH-):
Інгібітары РНКазы часта дадаюць у рэакцыі зваротнай транскрыпцыі, каб павялічыць даўжыню і выхад сінтэзу кДНК.Інгібітар РНКазы дадаецца ў першай рэакцыі ланцуговага сінтэзу ў прысутнасці буфераў і аднаўляльнікаў, такіх як ДТТ, таму што працэс папярэдняга сінтэзу кДНК дэнатуруе інгібітар, вызваляючы тым самым звязаныя РНКазы, якія дэградуюць РНК.Інгібітар бялковай РНКазы прадухіляе толькі дэградацыю РНКаз РНКазамі A, B, C і не прадухіляе трапленне РНКаз на скуру, таму трэба быць асцярожным, каб не ўвесці РНКазы з пальцаў, нягледзячы на выкарыстанне гэтых інгібітараў.
Зваротная транскрыптаза каталізуе ператварэнне РНК у кДНК.І M-MLV, і AMV валодаюць эндагеннай актыўнасцю РНКазы H у дадатак да ўласнай актыўнасці палімеразы.Актыўнасць РНКазы H канкуруе з актыўнасцю палімеразы за гетэразіготныя ланцугі, якія ўтвараюцца паміж матрыцамі РНК і праймерамі ДНК або падаўжальнымі ланцугамі кДНК, і дэградуе РНК: ланцугі РНК у комплексах ДНК.Матрыцы РНК, дэградаваныя актыўнасцю РНКазы, больш не могуць выкарыстоўвацца ў якасці эфектыўных субстратаў для сінтэзу кДНК, што зніжае выхад і працягласць сінтэзу кДНК.Такім чынам, ліквідацыя або значнае зніжэнне актыўнасці РНКазы зваротнай транскрыптазы будзе мець вялікую карысць.
Зваротная транскрыптаза SuperScriptⅡ, зваротная транскрыптаза MMLV РНКазы H- і зваротная транскрыптаза thermoScript, AMV РНКазы H- далі больш кДНК поўнай даўжыні, чым MMLV і AMV.На адчувальнасць RT-PCR ўплывае колькасць сінтэзаванай кДНК.ThermoScript значна больш адчувальны, чым AMV.Памер прадуктаў RT-PCR абмежаваны здольнасцю зваротнай транскрыптазы сінтэзаваць кДНК, асабліва пры кланаванні вялікіх ЦДНК.У параўнанні з MMLV, SuperScripⅡ значна павялічыў выхад доўгіх прадуктаў RT-PCR.Зваротная транскрыптаза RNaseH- таксама павышае тэрмічную стабільнасць, таму рэакцыю можна праводзіць пры тэмпературах, вышэйшых за нармальныя 37-42 ℃.У прапанаваных умовах сінтэзу выкарыстоўваліся аліга (dT) праймеры і 10 мкКі [альфа-р] dCTP.Агульная прадукцыя першай ланцуга была разлічана з дапамогай метаду ападкаў TCA.Поўнаметражная кДНК была прааналізавана з дапамогай адсартаванага па памеры палоскі для выдалення і падліку ў шчолачным агарозным гелі.
3. Павышэнне тэмпературы захавання цяпла зваротнай транскрыпцыі:
Больш высокая тэмпература вытрымкі спрыяе раскрыццю другаснай структуры РНК і павышэнню выхаду рэакцыі.Для большасці шаблонаў РНК вытрымка РНК і праймера пры 65°C без буфера або солі, а затым іх хуткае астуджэнне на лёдзе ліквідуе большасць другасных структур і дазваляе праймерам звязвацца.Аднак некаторыя шаблоны ўсё яшчэ маюць другасную структуру, нават пасля тэрмічнай дэнатурацыі.Ампліфікацыю гэтых складаных шаблонаў можна выканаць з дапамогай зваротнай транскрыптазы ThermoScript і шляхам размяшчэння рэакцыі зваротнай транскрыптазы пры больш высокіх тэмпературах для паляпшэння ампліфікацыі.Больш высокія тэмпературы вытрымкі таксама могуць павялічыць спецыфічнасць, асабліва калі сінтэз кДНК выконваецца з выкарыстаннем генаспецыфічных праймераў (GSPS) (гл. Главу 3).Пры выкарыстанні GSP пераканайцеся, што значэнне Tm праймера супадае з меркаванай тэмпературай вытрымкі.Не выкарыстоўвайце аліга(dT) і выпадковыя праймеры пры тэмпературы вышэй за 60 ℃.Выпадковыя праймеры неабходна вытрымаць пры 25 ℃ на працягу 10 хвілін перад павышэннем да 60 ℃.У дадатак да выкарыстання больш высокіх тэмператур зваротнай транскрыпцыі, спецыфічнасць можа быць палепшана шляхам непасрэднага пераносу сумесі РНК/праймера з тэмпературы дэнатурацыі 65 ℃ на тэмпературу ўтрымання зваротнай транскрыпцыі і дадання папярэдне нагрэтай рэакцыйнай сумесі 2× (сінтэз тэрмічнага ініцыявання кДНК).Такі падыход дапамагае прадухіліць міжмалекулярнае спарванне асноў, якое адбываецца пры больш нізкіх тэмпературах.Выкарыстанне прыбора для ПЦР спрашчае шмат пераключэнняў тэмпературы, неабходных для RT-PCR.
Тэрмастабілізаваная палімераза Tth дзейнічае як ДНК-палімераза ў прысутнасці Mg2+ і РНК-палімераза ў прысутнасці Mn2+.Ён можа ўтрымліваць тэмпературу да 65 ℃.Аднак прысутнасць Mn2+ падчас ПЦР зніжае дакладнасць, што робіць палімеразу Tth менш прыдатнай для высокадакладнай ампліфікацыі, такой як кланаванне кДНК.Акрамя таго, Tth менш эфектыўны пры зваротнай транскрыпцыі, што зніжае адчувальнасць, і паколькі адзін фермент можа выконваць зваротную транскрыпцыю і ПЦР, кантрольныя рэакцыі без зваротнай транскрыпцыі нельга выкарыстоўваць для адрознення ампліфікаваных прадуктаў кДНК ад прадуктаў забруджанай геномнай ДНК.
4. Дабаўка, якая спрыяе зваротнай транскрыпцыі:
Даданне дабавак, у тым ліку гліцэрыны і ДМСО, у першую рэакцыю ланцуговага сінтэзу можа знізіць стабільнасць падвойнага ланцуга нуклеінавай кіслаты і раскруціць другасную структуру РНК.Можна дадаць да 20% гліцэрыны або 10% ДМСО без уплыву на актыўнасць SuperScriptⅡ або MMLV.AMV таксама можа пераносіць да 20% гліцэрыны без зніжэння актыўнасці.Каб максымізаваць адчувальнасць RT-PCR у рэакцыі зваротнай транскрыпцыі SuperScriptⅡ, можна дадаць 10% гліцэрыны і ізаляваць пры 45 ℃.Калі да ПЦР дадаць 1/10 прадукту рэтратранскрыпцыі-рэакцыі, канцэнтрацыя гліцэрыны ў рэакцыі ампліфікацыі складзе 0,4%, чаго недастаткова для інгібіравання ПЦР.
5. Апрацоўка РНКазы:
Адчувальнасць можна палепшыць, апрацаваўшы рэакцыі сінтэзу кДНК РНКазой перад ПЦР.Мяркуецца, што для некаторых шаблонаў РНК у рэакцыі сінтэзу кДНК прадухіляе звязванне прадуктаў ампліфікацыі, і ў гэтым выпадку апрацоўка РНКазой можа павялічыць адчувальнасць.Як правіла, лячэнне РНКазы H патрабуецца для ампліфікацыі адносна доўгай поўнаметражнай кДНК-матрыцы-мішэні, такой як туберозный шероз Ⅱ з нізкай копіяй.Для гэтага складанага шаблону РНКазаH узмацніла сігнал, які ствараецца кДНК, сінтэзаванай SuperScriptⅡ або AMV.Для большасці рэакцый RT-PCR апрацоўка РНКазой H неабавязковая, таму што этап дэнатурацыі ПЦР пры тэмпературы 95 ℃ звычайна гідралізуе РНК з комплексу РНК:ДНК.
6. Палепшаныя метады выяўлення невялікіх колькасцяў РНК:
RT-PCR асабліва складаная, калі даступныя толькі невялікія колькасці РНК.Даданне глікагену ў якасці носьбіта падчас падзелу РНК дапамагае павялічыць выхад невялікіх узораў.Глікаген без РНКазы можа быць дададзены адначасова з Тризолом.Глікаген раствараецца ў вадзе і можа заставацца ў воднай фазе з РНК, каб дапамагчы ў наступным ападку.Рэкамендуемая канцэнтрацыя глікагену без РНКазы складае 250 мкг/мл для ўзораў менш за 50 мг тканіны або 106 культывуемых клетак.
Даданне ацэтыляванага BSA да рэакцый зваротнай транскрыпцыі з выкарыстаннем SuperScriptⅡ можа павялічыць адчувальнасць, а для невялікіх колькасцяў РНК памяншэнне колькасці SuperScriptⅡ і даданне 40 адзінак інгібітара нуклеазы RnaseOut можа палепшыць узровень выяўлення.Калі глікаген выкарыстоўваецца для падзелу РНК, па-ранейшаму рэкамендуецца даданне BSA або інгібітараў РНКазы для рэакцый зваротнай транскрыпцыі з выкарыстаннем SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Павышэнне спецыфічнасці RT-PCR
1. Сінтэз cNDA:
Для ініцыяцыі сінтэзу кДНК першага ланцуга можна выкарыстоўваць тры розныя метады, і адносная спецыфічнасць кожнага метаду ўплывае на колькасць і тып сінтэзаванай кДНК.
Метад выпадковага праймера з'яўляецца найменш спецыфічным з трох метадаў.Праймеры адпальваюцца ў некалькіх месцах па ўсёй стэнаграме для атрымання кароткай кДНК няпоўнай даўжыні.Гэты метад часта выкарыстоўваецца для атрымання 5'-канцавых паслядоўнасцей і кДНК з матрыц РНК з другаснымі структурнымі ўчасткамі або з тэрмінавальнымі ўчасткамі, якія зваротная транскрыптаза не можа рэплікаваць.Каб атрымаць самую доўгую кДНК, суадносіны праймераў і РНК у кожным узоры РНК неабходна вызначыць эмпірычнаму.Пачатковая канцэнтрацыя выпадковых праймераў вагаецца ад 50 да 250 нг на 20 мкл рэакцыйнай сістэмы.Паколькі кДНК, сінтэзаваная з сумарнай РНК з выкарыстаннем выпадковых праймераў, у асноўным з'яўляецца рыбасомальнай РНК, у якасці шаблону звычайна выбіраюць полі(А)+РНК.
Ініцыяцыя Oligo(dT) больш спецыфічная, чым выпадковыя праймеры.Ён гібрыдызуецца з полі(А) хвастом, які знаходзіцца на 3'-канцы мРНК у большасці эукарыятычных клетак.Паколькі полі(А)+РНК складае прыкладна ад 1% да 2% ад агульнай колькасці РНК, колькасць і складанасць кДНК значна менш, чым пры выкарыстанні выпадковых праймераў.З-за сваёй высокай спецыфічнасці аліга(dT) звычайна не патрабуе аптымізацыі суадносін РНК і праймера і выбару полі(А)+.Рэкамендуецца выкарыстоўваць 0,5 мкг аліга(dT) на 20 мкл рэакцыйнай сістэмы.oligo(dT)12-18 падыходзіць для большасці RT-PCR.Сістэма ThermoScript RT-PCR забяспечвае аліга(dT)20 дзякуючы сваёй добрай тэрмічнай стабільнасці і падыходзіць для больш высокіх тэмператур захоўвання.
Генеспецыфічныя праймеры (GSP) - лепшыя спецыфічныя праймеры для этапу зваротнай транскрыпцыі.GSP - гэта антысэнсавы алігануклеазід, які можа спецыяльна гібрыдызавацца з паслядоўнасцямі прызначэння РНК, а не адпальваць усе РНК, як выпадковыя праймеры або аліга(dT).Правілы, якія выкарыстоўваюцца для распрацоўкі праймераў ПЦР, таксама прымяняюцца да распрацоўкі рэакцыі зваротнай транскрыпцыі GSP.GSP можа мець тую ж паслядоўнасць, што і праймер ампліфікацыі, адпалены ў канцы мРНК3', або GSP можа быць распрацаваны для адпалу ўніз па плыні з праймерам зваротнай ампліфікацыі.Для некаторых ампліфікаваных аб'ектаў неабходна распрацаваць некалькі антысэнсавых праймераў для паспяховай RT-PCR, таму што другасная структура РНК-мішэні можа перашкаджаць звязванню праймера.Прапануецца выкарыстоўваць 1 пмоль антысэнс GSP у першай сістэме рэакцыі ланцуговага сінтэзу 20 мкл.
2. Павышэнне тэмпературы захавання цяпла зваротнай транскрыпцыі:
Каб у поўнай меры скарыстацца спецыфічнасцю GSP, варта выкарыстоўваць зваротную транскриптазу з высокай тэрмічнай стабільнасцю.Тэрмастабільная зваротная транскрыптаза можа быць ізалявана пры больш высокіх тэмпературах для павышэння жорсткасці рэакцыі.Напрыклад, калі GSP адпальваецца пры 55°C, то спецыфіка GSP не выкарыстоўваецца цалкам, калі зваротная транскрыпцыя выконваецца пры 37°C з нізкай строгасцю з выкарыстаннем AMV або M-MLV.Аднак SuperScripⅡ і ThermoScript могуць уступаць у рэакцыю пры тэмпературы 50 ℃ і вышэй, што выключае неспецыфічныя прадукты, атрыманыя пры больш нізкіх тэмпературах.Для дасягнення максімальнай спецыфічнасці сумесь РНК/праймер можа быць перанесена непасрэдна з тэмпературы дэнатурацыі 65 ℃ на тэмпературу ўтрымання зваротнай транскрыпцыі з даданнем папярэдне нагрэтай 2-кратнай рэакцыйнай сумесі (тэрмічнае ініцыяванне сінтэзу кДНК).Гэта дапамагае прадухіліць спарванне асноў паміж малекуламі пры нізкіх тэмпературах.Выкарыстанне прыбора для ПЦР спрашчае мноства тэмпературных пераходаў, неабходных для RT-PCR.
3. Паменшыць забруджванне геномнай ДНК:
Адной з патэнцыйных цяжкасцей з RT-PCR з'яўляецца тое, што РНК забруджвае геномную ДНК.Выкарыстанне лепшых метадаў падзелу РНК, такіх як рэагент Трызол, памяншае забруджванне геномнай ДНК у прэпаратах РНК.Каб пазбегнуць прадуктаў, атрыманых з геномнай ДНК, РНК можна апрацаваць ДНК ступені ампліфікацыіⅠ для выдалення забруджанай ДНК перад зваротнай транскрыпцыяй.Узоры вытрымлівалі пры 65 ℃ у 2,0 ммоль ЭДТА на працягу 10 хвілін, каб спыніць расшчапленне ДНКазойⅠ.ЭДТА хелатирует іёны магнію, каб прадухіліць залежны ад іёнаў магнію гідроліз РНК, які адбываецца пры высокіх тэмпературах.
Каб аддзяліць ампліфікаваную кДНК ад прадукту ампліфікацыі геномнай ДНК, можна распрацаваць праймеры, якія адпальваюць асобна з аддзеленым экзонам.ПЦР-прадукты, атрыманыя з кДНК, будуць карацейшымі, чым прадукты, атрыманыя з забруджанай геномнай ДНК.Кантраляваны эксперымент без зваротнай транскрыпцыі таксама праводзіцца на кожнай шаблоне РНК, каб вызначыць, ці з'яўляецца дадзены фрагмент геномнай ДНК або кДНК.Прадукты ПЦР, атрыманыя ў адсутнасць зваротнай транскрыпцыі, атрымліваюць з геному.
Звязаны прадукт
- Аднаэтапны набор дазваляе праводзіць зваротную транскрыпцыю і ПЦР у адной прабірцы.Трэба толькі дадаць матрычную РНК, спецыфічныя праймеры ПЦР і ddH без РНКазы2O.
-Колькасны аналіз РНК у рэжыме рэальнага часу можна правесці хутка і дакладна.
-У камплекце выкарыстоўваецца унікальны рэагент для зваротнай транскрыпцыі Foregene і ДНК-палімераза Foregene HotStar Taq у спалучэнні з унікальнай рэакцыйнай сістэмай для эфектыўнага павышэння эфектыўнасці ампліфікацыі і спецыфічнасці рэакцыі.
- Аптымізаваная рэакцыйная сістэма робіць рэакцыю больш высокай адчувальнасцю выяўлення, больш высокай тэрмічнай стабільнасцю і лепшай талерантнасцю.
RT Easy II (з GDNase) Майстар-прэмікс для сінтэзу першай ніткі CDNA для ПЦР у рэальным часе з GDNase
- Эфектыўная магчымасць выдалення гДНК, якая можа выдаліць гДНК у шаблоне на працягу 2 хвілін.
- Эфектыўная сістэма зваротнай транскрыпцыі, для завяршэння сінтэзу першай ніткі кДНК патрабуецца ўсяго 15 хвілін.
-Складаныя шаблоны: шаблоны з высокім утрыманнем GC і складанай другаснай структурай таксама могуць быць адменены з высокай эфектыўнасцю.
-Высокаадчувальная сістэма зваротнай транскрыпцыі, шаблоны ўзроўню pg таксама могуць атрымаць высакаякасную кДНК.
-Сістэма зваротнай транскрыпцыі мае высокую тэрмічную стабільнасць, аптымальная тэмпература рэакцыі складае 42 ℃, і яна па-ранейшаму мае добрую прадукцыйнасць зваротнай транскрыпцыі пры 50 ℃.
Час публікацыі: 7 сакавіка 2023 г
