COVID-19 - гэта інфекцыйнае захворванне, якое выклікаецца каранавірусам тыпу 2 з цяжкім вострым рэспіраторным сіндромам. Калі чалавек заражаны, найбольш распаўсюджаныя сімптомы ўключаюць ліхаманку, кашаль і дыхавіцу.

Узоры, якія выкарыстоўваюцца для аналізу, можна браць з дапамогай мазкоў з насаглоткі або ротаглоткі.

Што такое ПЦР?

Стандартны метад выяўлення каронавіруса - палімеразная ланцуговая рэакцыя, ПЦР.Гэта метад, які шырока выкарыстоўваецца ў малекулярнай біялогіі.Ён можа хутка скапіяваць ад мільёнаў да мільярдаў пэўных фрагментаў ДНК.

Новы каранавірус змяшчае вельмі доўгі адналанцуговы геном РНК.Каб выявіць гэтыя вірусы з дапамогай ПЦР, малекулы РНК павінны быць пераўтвораны ў камплементарныя паслядоўнасці ДНК з дапамогай зваротнай транскрыптазы, а затым зноў сінтэзаваная ДНК можа быць ампліфікавана стандартнымі працэдурамі ПЦР, якія шырока вядомыя як RT-PCR.

Працэс RT-PCR

Вылучэнне РНК

Каб ажыццявіць гэты метад, у асноўным неабходна вылучыць РНК віруса.Для зручнага, хуткага і эфектыўнага падзелу можна выкарыстоўваць розныя наборы для ачысткі РНК.

Каб атрымаць вірусную РНК з дапамогай камерцыйнага набору, спачатку дадайце ўзор у мікрацэнтрыфужную прабірку, а затым змяшайце яго з буферам для лізісу.Гэты буфер моцна дэнатураваны і звычайна складаецца з фенолу і гуанідзін-ізатыцыяната.Акрамя таго, інгібітары РНКазы звычайна прысутнічаюць у буферы лізіс для забеспячэння ізаляцыі непашкоджанай віруснай РНК.

Пасля дадання буфера для лізісу змяшайце прабірку для змешвання імпульсам і інкубуйце пры пакаёвай тэмпературы.Затым вірус лизируется ва ўмовах высокай дэнатурацыі, якія забяспечваюцца буферам для лізісу.

Пасля лізісу ўзору для працэдуры ачысткі выкарыстоўваецца цэнтрыфужная прабірка.Узор загружаюць у центрифужную прабірку, а затым центрифугируют.

Гэтая працэдура ўяўляе сабой метад экстракцыі цвёрдай фазы, пры якім нерухомая фаза складаецца з матрыцы з сілікагеля.

У аптымальных умовах солі і pH малекулы РНК звязваюцца з мембранай дыяксіду крэмнія.

Пры гэтым выдаляецца бялок і іншыя забруджвання.

Пасля цэнтрыфугавання пастаўце цэнтрыфужную прабірку ў чыстую прабірку для збору, выкіньце фільтрат і дадайце прамывальны буфер.

Зноў пастаўце прабірку ў цэнтрыфугу, каб буфер для прамывання прайшоў праз мембрану.Гэта прывядзе да выдалення ўсіх пакінутых прымешак з мембраны, пакінуўшы толькі РНК, звязаную з сілікагелем.

Пасля прамывання ўзору пастаўце прабірку ў чыстую мікрацэнтрыфужную прабірку і дадайце буфер для элюіравання.

Затым яго цэнтрыфугуюць, каб прымусіць элюирующий буфер прайсці праз мембрану.Буфер для элюцыі выдаляе вірусную РНК са спінавай калонкі і атрымлівае вычышчаную РНК без бялкоў, інгібітараў і іншых забруджванняў.

КРОК 2

Змешаны канцэнтрат

Пасля экстракцыі віруснай РНК наступным этапам з'яўляецца падрыхтоўка рэакцыйнай сумесі для ПЦР-ампліфікацыі.На гэтым этапе выкарыстоўваецца канцэнтрат.Гэты канцэнтраваны раствор з'яўляецца папярэдне змешаным канцэнтраваным растворам, які складаецца з папярэдняй сумесі, зваротнай транскрыптазы, нуклеатыдаў, прамога праймера, зваротнага праймера, зонда TaqMan і ДНК-палімеразы.

Нарэшце, каб завяршыць гэтую рэакцыйную сумесь, дадаецца шаблон РНК.Прабіркі змешваюць з дапамогай імпульснага вартэксавання, а затым рэакцыйную сумесь загружаюць у пласціну ПЦР.Планшэт ПЦР звычайна змяшчае 96 лунак і можа аналізаваць некалькі ўзораў адначасова.

КРОК 3

ПЦР-ампліфікацыя

Затым змесціце пласціну ў ПЦР-апарат, які па сутнасці з'яўляецца тэрмацыклерам.

RT-PCR у рэжыме рэальнага часу выкарыстоўваецца для выяўлення новага каранавіруса 2019 года шляхам узмацнення мэтавай паслядоўнасці ў гене RdrRP, гене E і гене N.Выбар мэтавага гена залежыць ад паслядоўнасці праймера і зонда.

Першым этапам RT-PCR з'яўляецца зваротная транскрыпцыя.Сінтэзуецца першая нітка камплементарнай ДНК, якая ініцыюецца зваротным праймером ПЦР, які звязваецца з камплементарнай часткай геному віруснай РНК.Затым зваротная транскрыптаза дадае нуклеатыды ДНК да 3′-канца праймера, каб сінтэзаваць ДНК, камплементарную віруснай РНК.Тэмпература і працягласць гэтага этапу залежаць ад выкарыстоўваных праймераў, мэтавай РНК і зваротнай транскрыптазы.

Далей прымяняецца пачатковая стадыя дэнатурацыі, якая прыводзіць да дэнатурацыі гібрыду РНК-ДНК.Гэты этап неабходны для актывацыі ДНК-полимеразы.Пры гэтым инактивируется зваротная транскриптаза.

ПЦР складаецца з серыі цеплавых цыклаў.Кожны цыкл складаецца з этапаў дэнатурацыі, адпалу і пашырэння.

Этап дэнатурацыі ўключае нагрэў рэакцыйнай камеры да 95 градусаў па Цэльсіі і выкарыстанне яе для дэнатурацыі двухцепочечной шаблону ДНК.

На наступным этапе тэмпература рэакцыі зніжаецца да 58 градусаў па Цэльсію, дазваляючы прамому праймеру адпаліцца з камплементарнай часткай яго адналанцуговай ДНК-матрыцы.Тэмпература адпалу напрамую залежыць ад даўжыні і складу грунтоўкі.

На этапе падаўжэння ДНК-палімераза сінтэзуе новы ланцуг ДНК, які з'яўляецца камплементарным ланцугу ДНК-матрыцы.Шляхам дадання свабодных ядраў, камплементарных шаблону ў напрамку 5'-3' ад рэакцыйнай сумесі.Тэмпература гэтага этапу залежыць ад выкарыстоўванай ДНК-палімеразы.

Пасля першага цыклу атрымліваецца двухцепочечная ДНК-мішэнь.

Затым увядзіце другі цыкл.Двухцепочечная ДНК дэнатуруецца для атрымання дзвюх аднацепочечных малекул ДНК.

На наступным этапе тэмпература рэакцыі зніжаецца, праймеры адпальваюцца да кожнай адналанцуговай ДНК-матрыцы, а зонд Taq-man адпальваецца да камплементарнай часткі ДНК-мішэні.

Зонд TaqMan складаецца з флюарафора, кавалентна звязанага з 5′-канцом алігануклеатыднага зонда.Пры ўзбуджэнні крыніцай святла цыклера флюарафор выпраменьвае флуарэсцэнцыю.Акрамя таго, зонд складаецца з гасільніка на 3′-канцы.Блізкасць рэпарцёрнага гена да гасільніка перашкаджае выяўленню флуарэсцэнцыі.

На этапе падаўжэння ДНК-палімераза сінтэзуе новы ланцуг.Калі палімераза дасягае зонда TaqMan, яго эндагенная актыўнасць 5'нуклеазы расшчапляе зонд, аддзяляючы фарбавальнік ад гасільніка.

З кожным цыклам ПЦР вызваляецца больш малекул фарбавальніка, што прыводзіць да павелічэння інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі, прапарцыйнай колькасці сінтэзаваных ампліконаў.

Гэты метад дазваляе ацаніць колькасць дадзенай паслядоўнасці ў выбарцы.У кожным цыкле колькасць двухцепочечных фрагментаў ДНК падвойваецца.Такім чынам, ПЦР можна выкарыстоўваць для аналізу вельмі маленькіх узораў.

Для вымярэння люмінесцэнтнага сігналу, вальфрамавай галагенавай лямпы, фільтра ўзбуджэння, адбівальніка, лінзы, эмісійнага фільтра і прылады з зарадавай сувяззю выкарыстоўвайце ПЗС-камеру.

КРОК 4 Выявіць

Для вымярэння люмінесцэнтнага сігналу, вальфрамавай галагенавай лямпы, фільтра ўзбуджэння, адбівальніка, лінзы, эмісійнага фільтра і прылады з зарадавай сувяззю выкарыстоўвайце ПЗС-камеру.

Адфільтраванае святло ад лямпы адлюстроўваецца адбівальнікам, праходзіць праз кандэнсатарную лінзу і факусуецца ў цэнтры кожнага адтуліны.Затым флуарэсцэнцыя, якая выпраменьваецца з адтуліны, адлюстроўваецца ад люстэрка, праходзіць праз эмісійны фільтр і выяўляецца ПЗС-камерай.У кожным цыкле ПЦР самаўзбуджаны флюарафорны святло можа быць выяўлены з дапамогай ПЗС.

Ён пераўтворыць захопленае святло ў лічбавыя дадзеныя.Гэты метад называецца ПЦР у рэальным часе, і ён дазваляе ў рэжыме рэальнага часу назіраць за ходам ПЦР-рэакцыі.