ПЦР (палімеразная ланцуговая рэакцыя) - гэта адна з тэхналогій in vitro ампліфікацыі ДНК, гісторыя якой налічвае больш за 30 гадоў.

У 1983 годзе тэхналогію ПЦР увёў Кэры Муліс з Цэтуса, ЗША. У 1985 годзе Муліс падаў заяўку на патэнт на ПЦР і ў тым жа годзе апублікаваў першую акадэмічную працу па ПЦР па навуцы.За сваю працу Маліс атрымаў Нобелеўскую прэмію па хіміі ў 1993 годзе.

Асноўныя прынцыпы ПЦР

ПЦР можа ўзмацніць мэтавыя фрагменты ДНК больш чым у мільён разоў.Прынцып заключаецца ў каталізе ДНК-палімеразы з выкарыстаннем бацькоўскай ланцуга ДНК у якасці шаблону і спецыфічнага праймера ў якасці адпраўной кропкі для падаўжэння.Ён прайграваецца ў прабірцы праз такія этапы, як дэнатурацыя, адпал і пашырэнне.Працэс даччынай ланцуга ДНК, камплементарны матрычнай ДНК бацькоўскага ланцуга.

Стандартны працэс ПЦР дзеліцца на тры этапы:

1.Дэнатурацыя: выкарыстоўвайце высокую тэмпературу для падзелу двайных ланцугоў ДНК.Вадародная сувязь паміж падвойнымі ланцугамі ДНК разрываецца пры высокай тэмпературы (93-98 ℃).

2.Адпал: пасля аддзялення двухцепочечной ДНК панізьце тэмпературу, каб праймер мог звязацца з аднацепочечной ДНК.

3.Пашырэнне: ДНК-палімераза пачынае сінтэзаваць камплементарныя ніткі ўздоўж нітак ДНК з праймераў, звязаных пры паніжэнні тэмпературы.Калі падаўжэнне завершана, цыкл завяршаецца, і колькасць фрагментаў ДНК падвойваецца

Паўтарыўшы гэтыя тры этапы 25-35 разоў, колькасць фрагментаў ДНК будзе павялічвацца ў геаметрычнай прагрэсіі.

Вынаходлівасць ПЦР заключаецца ў тым, што розныя праймеры могуць быць распрацаваны для розных генаў-мішэняў, так што фрагменты гена-мішэні могуць быць узмацнены за кароткі прамежак часу.

Пакуль ПЦР можна падзяліць на тры катэгорыі, а менавіта звычайную ПЦР, флуоресцентную колькасную ПЦР і лічбавую ПЦР.

Звычайная ПЦР першага пакалення

Выкарыстоўвайце звычайны прыбор для ампліфікацыі ПЦР для ампліфікацыі гена-мішэні, а затым выкарыстоўвайце электрафарэз у агарозным гелі для выяўлення прадукту, можна зрабіць толькі якасны аналіз.

Асноўныя недахопы ПЦР першага пакалення:

1. Схільнасць да неспецыфічнага ўзмацнення і прытворнададатных вынікаў.

2. Выяўленне займае шмат часу, а аперацыя грувасткая.

3. Можна правесці толькі якасны тэст

ПЦР другога пакалення ў рэальным часе

ПЦР у рэальным часе, таксама вядомая як кПЦР, выкарыстоўвае люмінесцэнтныя зонды, якія могуць паказваць ход рэакцыйнай сістэмы, і кантралюе назапашванне прадуктаў ампліфікацыі праз назапашванне флуоресцентных сігналаў і ацэньвае вынікі па крывой флуарэсцэнцыі.Яго можна вызначыць колькасна з дапамогай значэння Cq і стандартнай крывой.

Паколькі тэхналогія кПЦР праводзіцца ў закрытай сістэме, верагоднасць заражэння зніжаецца, а сігнал флуарэсцэнцыі можна кантраляваць для колькаснага выяўлення, таму яна найбольш шырока выкарыстоўваецца ў клінічнай практыцы і стала дамінуючай тэхналогіяй у ПЦР.

Флуарэсцэнтныя рэчывы, якія выкарыстоўваюцца ў флуоресцентной колькаснай ПЦР у рэжыме рэальнага часу, можна падзяліць на: флуоресцентный зонд TaqMan, малекулярныя маякі і флуоресцентный фарбавальнік.

1) Флуарэсцэнтны зонд TaqMan:

Падчас ПЦР-ампліфікацыі пры даданні пары праймераў дадаецца спецыфічны флуоресцентный зонд.Зонд уяўляе сабой алігануклеатыд, і абодва канцы пазначаны рэпарцёрнай флуоресцентной групай і тушыцельнай флуоресцентной групай.

Калі зонд цэлы, флуоресцентный сігнал, выпраменьваны групай рэпарцёраў, паглынаецца групай тушэння;падчас ПЦР-ампліфікацыі экзануклеазная актыўнасць 5'-3' фермента Taq расшчапляе і разбурае зонд, робячы рэпарцёрную флуоресцентную групу і тушыцель. Флуарэсцэнтная група аддзяляецца, каб сістэма маніторынгу флуарэсцэнцыі магла прымаць сігнал флуарэсцэнцыі, гэта значыць кожны раз, калі ланцужок ДНК узмацняецца, утвараецца флуоресцентная малекула, і адбываецца назапашванне сігналу флуарэсцэнцыі цалкам сінхранізуецца з адукацыяй прадукту ПЦР.

2) Флуарэсцэнтны фарбавальнік SYBR:

У рэакцыйную сістэму ПЦР дадаецца лішак флуоресцентного фарбавальніка SYBR.Пасля таго, як флуарэсцэнтны фарбавальнік SYBR неспецыяльна ўключаны ў двухланцуговую ДНК, ён выпраменьвае флуарэсцэнтны сігнал.Малекула фарбавальніка SYBR, якая не ўключана ў ланцужок, не будзе выпраменьваць флуарэсцэнтны сігнал, тым самым забяспечваючы флуарэсцэнтны сігнал. Павелічэнне колькасці прадуктаў ПЦР цалкам сінхранізавана з павелічэннем прадуктаў ПЦР.SYBR звязваецца толькі з двухцепочечной ДНК, таму крывую плаўлення можна выкарыстоўваць, каб вызначыць, ці з'яўляецца рэакцыя ПЦР спецыфічнай.

3) Малекулярны маяк:

Гэта двойчы пазначаны олигонуклеотидный зонд з пятлёй сцябла, які ўтварае шпількавую структуру прыкладна з 8 асноў на 5 і 3 канцах.Паслядоўнасці нуклеінавых кіслот на абодвух канцах з'яўляюцца камплементарна спаранымі, у выніку чаго флуарэсцэнтная група і тушаючая група становяцца цеснымі.Блізка, флуарэсцэнцыі не будзе.

Пасля генерацыі прадукту ПЦР падчас працэсу адпалу сярэдняя частка малекулярнага маяка спалучаецца з пэўнай паслядоўнасцю ДНК, а флуоресцентный ген аддзяляецца ад гена тушыцеля для атрымання флуарэсцэнцыі.

Асноўныя недахопы ПЦР другога пакалення:

Адчувальнасць па-ранейшаму недастатковая, і выяўленне малакопійных асобнікаў недакладнае.

Ёсць уплыў фонавага значэння, і вынік успрымальны да перашкод.

Калі ў рэакцыйнай сістэме ёсць інгібітары ПЦР, вынікі выяўлення адчувальныя да перашкод.

Лічбавая ПЦР трэцяга пакалення

Лічбавая ПЦР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) разлічвае колькасць копій мэтавай паслядоўнасці шляхам выяўлення канчатковай кропкі і можа выконваць дакладнае абсалютнае колькаснае выяўленне без выкарыстання ўнутранага кантролю і стандартных крывых.

Лічбавая ПЦР выкарыстоўвае выяўленне канчатковай кропкі і не залежыць ад значэння Ct (парог цыклу), таму на лічбавую ПЦР-рэакцыю менш ўплывае эфектыўнасць ампліфікацыі, а талерантнасць да інгібітараў ПЦР-рэакцыі паляпшаецца з высокай дакладнасцю і ўзнаўляльнасцю.

Дзякуючы асаблівасцям высокай адчувальнасці і высокай дакладнасці, інгібітары ПЦР-рэакцыі не так лёгка ўмешваюцца ў яго, і ён можа дасягнуць сапраўднага абсалютнага колькаснага вызначэння без стандартных прадуктаў, што стала гарачай кропкай даследаванняў і прымянення.

У залежнасці ад розных формаў рэакцыйнага блока, яго можна падзяліць на тры асноўныя тыпы: мікрафлюідныя, чыпавыя і кропельныя сістэмы.

1) Мікрафлюідычная лічбавая ПЦР, mdPCR:

На аснове мікрафлюіднай тэхналогіі аддзяляецца шаблон ДНК.Мікрафлюідная тэхналогія можа рэалізаваць нанаабнаўленне ўзору або генерацыю меншых кропель, але кроплі патрабуюць спецыяльнага метаду адсорбцыі, а затым у спалучэнні з рэакцыйнай сістэмай ПЦР.мдПЦР паступова замянілі іншыя метады.

2) Кропельная лічбавая ПЦР, ddPCR:

Выкарыстоўвайце тэхналогію генерацыі кропель вады ў алеі для апрацоўкі ўзору на кроплі і падзяліце рэакцыйную сістэму, якая змяшчае малекулы нуклеінавых кіслот, на тысячы нанапамерных кропель, кожная з якіх не ўтрымлівае малекулы-мішэні нуклеінавай кіслаты, якую трэба выявіць, або ўтрымлівае ад адной да некалькіх малекул-мішэняў нуклеінавай кіслаты, якія трэба праверыць.

3) Лічбавая ПЦР на аснове чыпа, cdPCR:

Выкарыстоўвайце інтэграваную тэхналогію руху вадкасці, каб выгравіраваць мноства мікратрубак і мікраполасці на крэмніевых пласцінах або кварцавым шкле, а таксама кантраляваць паток раствора праз розныя рэгулюючыя клапаны і падзяліць вадкасць узору на нанаметры аднолькавага памеру ў рэакцыйныя лункі для лічбавай ПЦР-рэакцыі для дасягнення абсалютнага колькаснага вызначэння.

Асноўныя недахопы ПЦР трэцяга пакалення:

Абсталяванне і рэактывы дарагія.

Патрабаванні да якасці шаблона высокія.Калі колькасць у шаблоне перавышае колькасць мікрасістэмы, яе будзе немагчыма вызначыць, а калі яна занадта малая, дакладнасць колькаснага вызначэння будзе зніжана.

Ілжывыя спрацоўванні таксама могуць быць атрыманы пры неспецыфічным узмацненні.