ПЦР, множны ПЦР, ПЦР in situ, Зваротная ПЦР, RT-PCR, кПЦР（1）–ПЦР

Мы разбяром паняцці, этапы і дэталі розных ПЦР

Ⅰ. ПЦР

Палімеразная ланцуговая рэакцыя, званая ПЦР, - гэта малекулярна-біялагічная тэхналогія, якая выкарыстоўваецца для павелічэння пэўных фрагментаў ДНК.Гэта можна разглядаць як асаблівую рэплікацыю ДНК in vitro.ДНК-палімераза (ДНК-палімераза I) была выяўлена яшчэ ў 1955 годзе, а фрагмент Кленава кішачнай палачкі, які мае эксперыментальную каштоўнасць і практычнасць, быў адкрыты доктарам Х. Кленавам у пачатку 1970-х гадоў, але паколькі гэты фермент не пераносіць тэмпературы, высокая тэмпература можа яго дэгенераваць, таму ён не адпавядае палімеразнай ланцуговай рэакцыі з дэгенерацыяй пры высокай тэмпературы.Ферменты, якія выкарыстоўваюцца сёння (так званыя палімераза Taq), былі выдзелены з Thermus aquaticus, бактэрыі гарачай крыніцы ў 1976 годзе. Яго характарыстыка заключаецца ў тым, што ён можа супрацьстаяць высокай тэмпературы і з'яўляецца ідэальным ферментам, але ён шырока выкарыстоўваецца пасля 1980-х гадоў.Арыгінальная канцэпцыя арыгінальнага прымітыўнага прататыпа ПЦР падобная на аднаўленне і капіраванне генаў, прапанаваную доктарам К'елам Клеппе ў 1971 г. Ён апублікаваў першую простую і кароткатэрміновую копію гена (падобна рэакцыям першага цыклу ПЦР).ПЦР, распрацаваная сёння, была распрацавана доктарам Кэры Б. Мулісам у 1983 годзе. У той год доктар Муліс абслугоўваў кампаніі, якія займаюцца ПЦР, таму ПЦР мае асаблівы статус у індустрыі ПЦР.Доктар Муліс афіцыйна апублікаваў першую адпаведную працу з Сайкі і іншымі ў 1985 годзе. З тых часоў выкарыстанне ПЦР праходзіць тысячы міль у дзень, і можна сказаць, што якасць адпаведных работ робіць многія іншыя метады даследавання непрыемнымі.У далейшым тэхналогія ПЦР шырока выкарыстоўваецца ў біялагічных навуковых даследаваннях і клінічных прымяненнях, стаўшы найважнейшай тэхналогіяй малекулярна-біялагічных даследаванняў.Маліс таксама атрымаў Нобелеўскую прэмію па хіміі ў 1993 годзе.

ПЦРПрынцып

Асноўны прынцып тэхналогіі ПЦР падобны да натуральнага працэсу рэплікацыі ДНК, і яе спецыфічнасць залежыць ад алігануклеатыднага праймера, які камплементарны абодвум канцам паслядоўнасці-мішэні.ПЦР складаецца з трох асноўных этапаў рэакцыі дэгенерацыі-адпалу-пашырэння: ①Дэгенерацыя ДНК-матрыцы: пасля таго, як ДНК-матрыца нагрэецца прыкладна да 93°C на працягу пэўнага перыяду часу, раствор двайны ДНК для двухланцуговай ДНК, утворанай у выніку ПЦР-ампліфікацыі ДНК-матрыцы, пакідае адзін ланцуг, каб яго можна было аб'яднаць з праймерам для падрыхтоўкі да наступнай рэакцыі.②Адпал (злучэнне) матрычнай ДНК і праймера: пасля таго як матрычная ДНК награваецца і ператвараецца ў адзіны ланцужок, тэмпература зніжаецца прыкладна да 55°C.Камплементарная паслядоўнасць праймера і матрычнай ДНК адналанцуговая.③Пашырэнне праймера: шаблон ДНК - звязванне праймера заснавана на дзеянні TaqДНК-палімеразы з dNTP у якасці сыравіны для рэакцыі.Захоўвайце прынцып рэплікацыі, сінтэзуйце новы напаўзарэзерваваны ланцужок копій, які дапаўняе шаблонны ланцужок ДНК, і паўтарыце тры працэсы цыкла дэгенерацыя-адпал-падаўжэнне, каб атрымаць больш «напаўзарэзерваваны ланцужок копій», і гэты новы ланцужок зноў даступны. Станьце шаблонам для наступнага цыклу.Завяршэнне цыкла займае 2-4 хвіліны, ген-мішэнь можа быць узмацнены ў некалькі мільёнаў разоў за 2-3 гадзіны.

СтандартныПЦРСістэма рэакцыі

Пяць элементаў рэакцыі ПЦР

У ПЦР-рэакцыі ўдзельнічаюць у асноўным пяць відаў рэчываў, а менавіта праймер, фермент, dNTP, матрыца і буфер (патрабуецца Mg2+).[Працэдура ПЦР]

Стандартны працэс ПЦР дзеліцца на тры этапы

1. Дэгенерацыя ДНК (90°C-96°C): Двухланцужковыя шаблоны ДНК пад дзеяннем тэмпературы разрываюць вадародныя сувязі, утвараючы адналанцуговую ДНК.

2. Адпал (25 ℃ -65 ℃): тэмпература сістэмы зніжаецца, праймер аб'ядноўваецца з шаблонам ДНК, каб утварыць лакальны двайны ланцуг.

3. Пашырэнне (70℃ -75℃): пад дзеяннем фермента Taq (каля 72°C, лепшая актыўнасць) dNTP выкарыстоўваецца ў якасці сыравіны, распасціраецца ад 5'-канца праймера → 3'-канца, сінтэз і шаблон дапаўняюць адзін аднаго ланцужок ДНК.

Кожны цыкл дэнатуруецца, адпальваецца і пашыраецца, падвойваючы ўтрыманне ДНК.У цяперашні час з-за кароткай вобласці ампліфікацыі некаторыя ПЦР можна паўтарыць за вельмі кароткі час, нават калі актыўнасць фермента Taq не з'яўляецца аптымальнай, таму яе можна змяніць на два этапы, гэта значыць адпал і падаўжэнне можна выконваць пры 60°C-65°C адначасова.Для таго, каб паменшыць працэс ўздыму і астуджэння і палепшыць хуткасць рэакцыі.

Асаблівасці рэакцыі ПЦР

● Высокая спецыфіка

Канкрэтнымі вырашальнымі фактарамі ПЦР-адказу з'яўляюцца: ①Спецыфічная камбінацыя праймера і матрычнай ДНК.②Прынцып спарвання асноў.③Ляяльнасць рэакцыі сінтэзу палімеразы TaqDNA.④Спецыфічнасць і кансерватыўнасць мэтавага гена.

Правільнае спалучэнне праймераў і шаблонаў - гэта галоўнае.Звязванне праймера і шаблону і падаўжэнне ланцуга праймера заснаваныя на прынцыпе супадзення шчолачных асноў.Лаяльнасць рэакцый сінтэзу палімеразы і ўстойлівасць да высокай тэмпературы ДНК-палімеразы Taq для стварэння звязвання (злучэння) матрыцы і праймера ў рэакцыі могуць праводзіцца пры больш высокай тэмпературы.Спецыфічнасць спалучэння значна павялічваецца.Кліп можа падтрымліваць высокую ступень карэктнасці.Выбіраючы мэтавую генетычную вобласць з высокай кансерватыўнасцю і высокай кансерватыўнасцю, яе спецыфічнасць вышэй.

● Высокая адчувальнасць

Аб'ём вытворчасці прадуктаў ПЦР павялічваецца на індэкс, які можа пашырыць стартавы шаблон Picker (PG=10-12) для павышэння ўзроўню мікракантролера да ўзроўню мікраграмаў (мкг= -6).Клеткі-мішэні можна выявіць з 1 мільёна клетак;пры выяўленні вірусаў адчувальнасць ПЦР можа дасягаць 3 RFU (пустыя плямы, утвораныя адзінкі);мінімальны ўзровень выяўлення ў бактэрыялогіі складае 3 бактэрыі.

● Просты і хуткі

ПЦР-адлюстраванне выкарыстоўвае высокатэмпературную ДНК-палімеразу Taq, якая адначасова дадае рэакцыйны раствор, гэта значыць рэакцыю дэгенерацыі-адпалу-пашырэння ў растворы для ампліфікацыі ДНК і вадзяной лазні.Як правіла, рэакцыя ампліфікацыі завяршаецца праз 2-4 гадзіны.Дапоўненыя прадукты звычайна аналізуюцца з дапамогай электрычнага мяча, і не патрабуюць выкарыстання ізатопаў, радыеактыўнага забруджвання і лёгкага прасоўвання.

● Чысціня ўзору нізкая

Няма неабходнасці аддзяляць вірусы або бактэрыі і культурныя клеткі.Неапрацаваныя прадукты ДНК і РНК могуць быць выкарыстаны ў якасці ўзмацняльнікаў.Выяўленне ампліфікацыі ДНК можна выкарыстоўваць непасрэдна з выкарыстаннем клінічных узораў, такіх як кроў, вадкасць арганізма, вадкасць для прамывання кашлю, валасы, клеткі і жывыя тканіны.

ПЦРагульныя праблемы

● Ілжываадмоўныя, без узмоцненых палос

Ключавыя этапы рэакцыі ПЦР ўключаюць: ① падрыхтоўка нуклеінавых кіслот-матрыц, ② якасць і спецыфічнасць праймераў, ③ якасць ферментаў, ④ умовы цыклу ПЦР.Пошук прычыны таксама павінен быць прааналізаваны і вывучаны па спасылках вышэй.

Шаблоны: ① Шаблон змяшчае розныя бялкі, ② Шаблон змяшчае інгібітар фермента Taq, ③ Бялок у шаблоне не выдаляецца, асабліва бялок групы ў храмасоме.⑤ Дэмайнер дэгенерацыі нуклеінавых кіслот не з'яўляецца дбайным.Калі якасць ферментаў і праймераў добрая, няма паласы ўзмацнення, што, хутчэй за ўсё, з'яўляецца апрацоўкай стрававання ўзораў.З працэсам экстракцыі шаблоннай нуклеінавай кіслаты нешта не так, таму для падрыхтоўкі эфектыўнага і стабільнага раствора для стрававання яго працэдура павінна быць фіксаванай, а не адвольна змененай.

Інактывацыя фермента: новы фермент або абодва старыя і новыя ферменты павінны выкарыстоўвацца разам, каб прааналізаваць, страчана ці недастатковая актыўнасць фермента, што прыводзіць да ілжывых адмоўных вынікаў.Варта адзначыць, што пра фермент Taq або брамісты этидия часам забываюць.

Праймер: якасць праймера, канцэнтрацыя праймера і ці сіметрычная канцэнтрацыя двух праймераў.Гэта частая прычына няўдачы ПЦР, або павелічэнне паласы не ідэальнае і схільнае да дыфузіі.Ёсць праблемы з якасцю грунтовак некаторых партый.Два праймеры маюць высокую і нізкую канцэнтрацыю, што выклікае нізкаэфектыўнае асіметрычнае ўзмацненне.Меры процідзеяння: ① Выберыце добры праймер для сінтэзу адзінак.② Канцэнтрацыя праймера не толькі залежыць ад значэння OD, але таксама звяртае ўвагу на зыходную вадкасць праймера для правядзення электрафарэзу ў цукровым гелі з агару.Павінна быць зона грунтоўкі, а яркасць дзвюх грунтовак павінна быць аднолькавай.Belt, ПЦР можа быць няўдалым у гэты час, і гэта трэба вырашыць з дапамогай блока сінтэзу праймера.Калі праймер высокі, яркасць нізкая, і яго канцэнтрацыя павінна быць збалансавана пры развядзенні.③ Грунтоўка павінна быць аплачана і захоўвацца ў высокай канцэнтрацыі, каб прадухіліць шматразовае замарожванне або працяглае астуджэнне частак халадзільніка, што прывядзе да пагаршэння і дэградацыі грунтоўкі.④ Канструкцыя праймера неразумная, напрыклад, даўжыня праймера недастатковая, і паміж праймерамі ўтвараецца кластар.

Канцэнтрацыя Mg2+: Канцэнтрацыя іёнаў Mg2+ мае вялікі ўплыў на эфектыўнасць ПЦР-ампліфікацыі.Празмерная канцэнтрацыя можа паменшыць супрацьлеглы пол ампліфікацыі ПЦР.Калі канцэнтрацыя занадта нізкая, выхад ПЦР-ампліфікацыі прывядзе да збою ПЦР-ампліфікацыі без паласы пашырэння.

Змяненне аб'ёму рэакцыі: аб'ём, які выкарыстоўваецца пры ПЦР-ампліфікацыі, складае 20 мкл, 30 мкл і 50 мкл або 100 мкл, вялікі аб'ём заяўкі на ПЦР-ампліфікацыю ўсталёўваецца ў адпаведнасці з рознымі мэтамі навуковых даследаванняў і клінічных выпрабаванняў.Пасля вырабу невялікіх аб'ёмаў, такіх як 20 мкл, неабходна выконваць умовы шнура пры вырабе памеру, інакш ён выйдзе з ладу.

Фізічныя прычыны: трансфармацыя вельмі важная для ПЦР-ампліфікацыі.Калі тэмпература дэгенерацыі нізкая, час дэгенерацыі кароткі, гэта, верагодна, адбудзецца ў ілжывых адмоўных;занадта нізкая тэмпература адпалу можа выклікаць неспецыфічнае ўзмацненне і знізіць эфектыўнасць удзельнага ўзмацнення.Моцна ўплывае на камбінацыю праймераў і шаблонаў для зніжэння эфектыўнасці ПЦР-ампліфікацыі.Часам неабходна выкарыстоўваць стандартныя тэрмометры для выяўлення зменлівасці, адпалу і працяглай тэмпературы ў напаўняльніку або вадараспушчальнай пліты, што з'яўляецца адной з прычын няўдачы ПЦР.

Варыянты мэтавай паслядоўнасці: калі ўзнікае мэтавая паслядоўнасць, мутацыя або дэлецыя, камбінацыя прататыпа і шаблону аб'ядноўваецца, або з-за адсутнасці мэтавай паслядоўнасці праймер і шаблон страцяць камплементарную паслядоўнасць, і яе ПЦР-ампліфікацыя не будзе паспяховай.

● Ілжывы станоўчы вынік

Паласа ампліфікацыі ПЦР выглядае адпаведнай паласе мэтавай паслядоўнасці, і часам яе паласа больш акуратная і вышэйшая.

Дызайн праймера не падыходзіць: абраная паслядоўнасць ампліфікацыі і паслядоўнасць немэтавай ампліфікацыі гамалагічныя, таму пры ампліфікацыі ПЦР ампліфікаваныя прадукты ПЦР з'яўляюцца немэтавымі паслядоўнасцямі.Мэтавая паслядоўнасць занадта кароткая або праймер занадта кароткі, і яна схільная да ілжывых спрацоўванняў.Трэба перарабіць.

Перакрыжаванае забруджванне мэтавай паслядоўнасці або прадуктаў ампліфікацыі: ёсць дзве прычыны гэтага забруджвання: па-першае, перакрыжаванае забруджванне ўсяго геному або вялікіх сегментаў, што прыводзіць да ілжывых спрацоўванняў.Гэты від ілжывых спрацоўванняў можа быць вырашаны наступнымі метадамі: Будзьце асцярожныя і далікатныя падчас працы, каб прадухіліць удыханне мэтавай паслядоўнасці ў пісталет для ўзору або выплюхванне з цэнтрабежнай трубкі.За выключэннем ферментаў і рэчываў, якія не вытрымліваюць высокіх тэмператур, усе рэагенты або абсталяванне неабходна дэзінфікаваць пад высокім ціскам.Цэнтрабежныя трубы і ўзоры павінны быць выкарыстаны адначасова.Пры неабходнасці перад даданнем узораў рэакцыйная трубка і рэагент падвяргаюцца ўздзеянню ўльтрафіялетавых прамянёў для разбурэння існуючай нуклеінавай кіслаты.Па-другое, невялікія фрагменты ў забруджванні паветра.Гэтыя невялікія фрагменты карацей мэтавай паслядоўнасці, але яны маюць пэўную гамалогію.Яго можна зрошчваць адзін з адным.Пасля дапаўнення праймераў прадукт ПЦР можа быць пашыраны, што прывядзе да ілжывых станоўчых вынікаў.Ён можа быць выкарыстаны для памяншэння або ліквідацыі гнязда метад ПЦР.

● З'яўляецца неспецыфічная паласа ўзмацнення

Палосы, якія з'явіліся пасля ПЦР-ампліфікацыі, не адпавядаюць чаканаму памеру, або вялікія або малыя, або адначасова, або адначасова, спецыфічныя палосы ампліфікацыі і неспецыфічныя палосы ампліфікацыі.З'яўленне неспецыфічных палос: па-першае, праймеры з'яўляюцца няпоўнымі камплементарнымі паслядоўнасці-мішэні або полімерызацыя праймера з адукацыяй ды кластара.Па-другое, канцэнтрацыя іёнаў MG2+ занадта высокая, тэмпература адпалу занадта нізкая, і колькасць цыклаў ПЦР звязана.Па-другое, якасць і колькасць ферментаў.Часта ферменты адных крыніц схільныя да неспецыяльных палос, а ферменты іншай крыніцы не сустракаюцца.Часам таксама адбываецца неспецыфічнае ўзмацненне ферментаў.Меры процідзеяння: пры неабходнасці перароблены прывабныя аб'екты.Паменшыць колькасць фермента або замяніць фермент іншай крыніцы.Паменшыце колькасць асноўных, адпаведна павялічце колькасць шаблонаў і паменшыце колькасць цыклаў.Належным чынам павялічце тэмпературу адпалу або выкарыстоўвайце метад дзвюх тэмпературных кропак (дэгенерацыя 93°C, адпал і пашырэнне прыкладна пры 65°C).

● З'яўляецца адслойваецца жгут або пляма стужкі

ПЦР-ампліфікацыя часам здаецца нанесенай або шкарлупінай, або дывановым поясам.Па той прычыне, з-за празмернай колькасці ферментаў або нізкай якасці фермента, канцэнтрацыя dNTP занадта высокая, канцэнтрацыя Mg2+ занадта высокая, тэмпература адпалу занадта нізкая, а колькасць цыклаў занадта вялікая.Супрацьмеры: ①Паменшыце колькасць ферментаў або заменіце фермент з іншай крыніцы.②Паменшыць канцэнтрацыю dNTP ③Належным чынам знізіць канцэнтрацыю Mg2+.④Павялічце колькасць шаблонаў і паменшыце колькасць цыклаў.

Спадарожныя тавары

ПЦР Heroᵀᴹ (з фарбавальнікам)

◮ Больш высокая дакладнасць: у 6 разоў больш, чым звычайны фермент Taq;

◮ Больш высокая хуткасць узмацнення

◮ Большая адаптыўнасць шаблону

◮ Больш высокая эфектыўнасць узмацнення

◮ Устойлівасць да навакольнага асяроддзя мацней: змяшчаюць пры 37°C на тыдзень, падтрымліваючы больш за 90% актыўнасці;

◮ Ён мае 5'→3' ДНК-палімеразную актыўнасць і 5'→3' экзануклеазную актыўнасць, без 3'→5' экзануклеазнай актыўнасці.

PCR Easyᵀᴹ (з фарбавальнікам)

Унікальная рэакцыйная сістэма і высокаэфектыўная ДНК-палімераза Taq робяць рэакцыю ПЦР больш высокай эфектыўнасцю ампліфікацыі, спецыфічнасцю і адчувальнасцю.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (адзін крок)-SYBR Green I

◮ Аднаэтапны набор робіць дзве рэакцыі зваротнай транскрыпцыі і кПЦР у адной прабірцы, трэба толькі дадаць матрычную РНК, спецыфічныя праймеры для ПЦР і ddH без РНКазы₂O.

◮ Набор дазваляе хутка і эфектыўна аналізаваць РНК віруса або след РНК.

◮ У камплекце выкарыстоўваецца унікальны рэагент для зваротнай транскрыпцыі Foregene і ДНК-палімераза Foregene HotStar Taq у спалучэнні з унікальнай рэакцыйнай сістэмай для эфектыўнага павышэння эфектыўнасці ампліфікацыі і спецыфічнасці рэакцыі.

◮ Аптымізаваная сістэма рэакцыі робіць рэакцыю больш высокай адчувальнасцю выяўлення, больш моцнай тэрмічнай стабільнасцю і лепшай талерантнасцю.

◮ RT-qPCR Easy^TMНабор (One Step)-SYBR Green I пастаўляецца з унутраным эталонным фарбавальнікам ROX, які можа выкарыстоўвацца для ліквідацыі фону сігналу і памылак сігналу паміж лункамі, што зручна для выкарыстання кліентамі ў розных мадэлях прыбораў для колькаснай ПЦР.

RT лёгка^TMII (Майстар-прэмікс для сінтэз першай ніткі кДНК дляПЦР у рэальным часе)

- Эфектыўная магчымасць выдалення гДНК, якая можа выдаліць гДНК у шаблоне на працягу 2 хвілін.

- Эфектыўная сістэма зваротнай транскрыпцыі, для завяршэння сінтэзу першай ніткі кДНК патрабуецца ўсяго 15 хвілін.

-Складаныя шаблоны: шаблоны з высокім утрыманнем GC і складанай другаснай структурай таксама могуць быць адменены з высокай эфектыўнасцю.

-Высокаадчувальная сістэма зваротнай транскрыпцыі, шаблоны ўзроўню pg таксама могуць атрымаць высакаякасную кДНК.

-Сістэма зваротнай транскрыпцыі мае высокую тэрмічную стабільнасць, аптымальная тэмпература рэакцыі складае 42 ℃, і яна па-ранейшаму мае добрую прадукцыйнасць зваротнай транскрыпцыі пры 50 ℃.