RT-qPCR - гэта асноўны эксперымент малекулярнай біялогіі, і кожны павінен быць з ім знаёмы.У асноўным ён уключае тры этапы: экстракцыю РНК, зваротную транскрыпцыю ў кДНК і флуарэсцэнтную колькасную ПЦР у рэжыме рэальнага часу.Гэта не дапамагае, што адбываецца?Цалкам верагодна, што ёсць праблема зэксперымент па зваротнай транскрыпцыі!Хоць здаецца, што для эксперыменту па зваротнай транскрыпцыі неабходна толькі дадаць РНК, dNTP, праймеры ізваротная транскриптазау цэнтрыфужную прабірку і добра змяшайце, але ў працэсе фактычнай працы ёсць яшчэ шмат дэталяў, на якія трэба звярнуць увагу.Давайце даведаемся пра гэта!

Як судзіць аб якасці РНК?
Для атрымання кДНК якасць РНК мае вырашальнае значэнне!Якасць РНК можна вызначыць у асноўным з двух аспектаў:
(1) цэласнасць РНК:Цэласнасць РНК можна праверыць з дапамогай электрафарэзу ў агарозным гелі. Прымаючы ў якасці прыкладу эукарыёт, поўная сумарная РНК мае тры выразныя паласы, малекулярныя масы ад вялікай да малой складаюць 28S, 18S і 5S, а 28S удвая ярчэйшая за 18S;калі можна ўбачыць тры паласы, але тып паласы размыты або Дыфузія азначае, што РНК часткова дэградавала.У гэты час неадкладна выканайце рэакцыю зваротнай транскрыпцыі і адпаведна павялічце ўвод шаблону;калі відаць толькі паласу з невялікай малекулярнай масай або яе няма, значыць, РНК цалкам дэградавала і патрабуе паўторнай экстракцыі.Agilent 2100 паказвае цэласнасць РНК з дыяграмай пікаў і значэннем RIN.Калі нуклеінавая кіслата цэлая, базавая лінія электрафераграмы роўная;калі нуклеінавая кіслата моцна разбураецца, базавая лінія нераўнамерная і з'яўляецца больш пікаў дэградацыі;значэнне RIN адлюстроўвае цэласнасць РНК, у дыяпазоне 0-10, чым больш значэнне, тым лепш якасць РНК.Ну, чым вышэй ступень паўнаты.
(2) Чысціня РНК:Суадносіны OD260/280 можна вызначыць з дапамогай УФ-спектрафатаметрыі.Калі стаўленне OD260/280 складае ад 1,9 да 2,1, чысціня вельмі добрая.
Рэшткавая геномная ДНК можа прывесці да недакладных колькасных вынікаў
Калі РНК здабываецца, атрыманая РНК можа быць змешана з геномнай ДНК (гДНК), якая не была ачышчана.Такім чынам, кДНК пасля зваротнай транскрыпцыі таксама будзе змешвацца згДНК.Падчас нізкПЦРрэакцыя,кДНКі gDNA можа быць ампліфікаваны адначасова, што прыводзіць да адносна невялікага значэння CT, таму вынікі могуць быць неаб'ектыўнымі.
Такім чынам, што нам рабіць у гэтай сітуацыі?Foregeneпрапануе:
(1) Выканайце ачыстку геному на зваротнай РНК, якую можна выдаліць шляхам экстракцыі калонкі падчас экстракцыі РНК;
(2) Апрацуйце вынятую РНК ДНКазойI , але спыніць яго з ЭДТА;
рэагентаў зваротнай транскрыпцыіз модулямі ачысткі геному;

Як выбраць праймеры для зваротнай транскрыпцыі?
Праймеры зваротнай транскрыпцыі таксама ўплываюць на вынік рэакцыі зваротнай транскрыпцыі.Вы можаце выбраць выпадковыя праймеры, Oligo dT або ген-спецыфічныя праймеры для зваротнай транскрыпцыі ў адпаведнасці з канкрэтнымі абставінамі эксперыменту:
(1) Канкрэтныя стэнаграмы: рэкамендуюцца ген-спецыфічныя праймеры;
(2) Доўгія стэнаграмы фрагментаў: Рэкамендуюцца Oligo dT/ген-спецыфічныя праймеры;
(3) Унутраныя фрагменты доўгасегментных транскрыптаў: ген-спецыфічныя праймеры/ выпадковыя праймеры /выпадковыя праймеры + Oligo dT.Калі праводзіцца наступны эксперымент qPCR, Oligo dT нельга выкарыстоўваць самастойна, таму што выкарыстанне аднаго Oligo dT можа выклікаць зрушэнне 3' канца, што прывядзе да недакладных вынікаў эксперыменту qPCR;
(4) мікраРНК: Могуць выкарыстоўвацца праймеры ствалавой завесы або хваставыя праймеры.

У колькі разоў трэба разбавіць кДНК прадукту зваротнай транскрыпцыі для колькаснага вызначэння?
Пасля атрымання кДНК прадукту зваротнай транскрыпцыі вельмі важна, колькі разоў кДНК трэба развесці для эксперыментаў кПЦР.Калі канцэнтрацыя кДНК занадта высокая або занадта нізкая, гэта можа паўплываць на эфектыўнасць ампліфікацыі.Ці можна вымераць канцэнтрацыю кДНК і як гэта зрабіць?
(1) Немагчыма вымераць канцэнтрацыю кДНК прадукту зваротнай транскрыпцыі, таму што ў дадатак да прадукту кДНК прадукт зваротнай транскрыпцыі таксама змяшчае рэшткавы буфер зваротнай транскрыпцыі, зваротную транскрыптазу, праймеры і г.д., якія будуць перашкаджаць вынікам вымярэння канцэнтрацыі і выклікаць ненармальнае суадносіны OD260/280, OD260/230 і, такім чынам, не адлюстроўваюць сапраўднага выхаду кДНК.У гэты час, некаторыя сябры скажуць, што я буду вымяраць канцэнтрацыю пасля ачысткі;Тут Foregene хацеў бы нагадаць, што кДНК не рэкамендуецца ачышчаць, таму што даўжыня кДНК, атрыманая пры рэверсе, адрозніваецца, і кароткая кДНК будзе страчана пры ачыстцы.
(2) Дык што рабіць?Перад эксперыментам кПЦР можна вызначыць градыент развядзення кДНК з дапамогай папярэдняга эксперыменту.Напрыклад: выкарыстоўвайце асноўны раствор кДНК, 10-кратнае развядзенне і 100-кратнае развядзенне ў якасці шаблонаў для эксперыментаў кПЦР і выберыце каэфіцыент развядзення са значэннем CT у дыяпазоне 18-28.

Як павінна адбывацца зваротная транскрыпцыя мікраРНК?
мікраРНК - гэта адналанцуговая невялікая малекула РНК памерам каля 22 нт, якая не кадуе бялок.З-за яго кароткай даўжыні звычайны метад кПЦР цяжка непасрэдна вызначыць колькасна, таму часта неабходна падоўжыць мікраРНК;звычайна выкарыстоўваюцца метады зваротнай транскрыпцыі для микроРНК ўключаюць метад ствалавой завесы і метад хваста.
Метад ствалавой завесы заключаецца ў пашырэнні мікраРНК шляхам дадання праймераў ствалавой завесы.Гэты метад выяўлення мае больш высокую адчувальнасць і спецыфічнасць, але прапускная здольнасць выяўлення нізкая.Адна зваротная транскрыпцыя можа выявіць толькі адну мікраРНК і ўнутраную спасылку;метад дадання хваста складаецца з двух. Ён завяршаецца сумесным дзеяннем двух ферментаў, якімі з'яўляюцца полімераза PolyA і зваротная транскрыптаза.PolyA-палімераза адказвае за даданне хвастоў PolyA да мікраРНК, каб павялічыць яе даўжыню, а зваротная транскрыптаза выконвае рэакцыю зваротнай транскрыпцыі.Гэты метад мае высокую прадукцыйнасць выяўлення і можа выяўляць некалькі мікраРНК і ўнутраных спасылак у адной зваротнай транскрыпцыі, але адчувальнасць і спецыфічнасць у метадзе ствалавой завесы нізкія.