Значэнне Ct з'яўляецца найбольш важнай формай прадстаўлення вынікаў флуоресцентной колькаснай ПЦР.Ён выкарыстоўваецца для разліку адрозненняў у экспрэсіі генаў або колькасці копій гена.Такім чынам, якое значэнне Ct колькаснага вызначэння флуарэсцэнцыі лічыцца разумным?Як забяспечыць эфектыўны дыяпазон значэння Ct?

Што такое значэнне Ct?
Падчас працэсу ампліфікацыі qPCR адпаведная колькасць цыклаў ампліфікацыі (парог цыклу), калі сігнал флуарэсцэнцыі ўзмоцненага прадукту дасягае зададзенага парога флуарэсцэнцыі.C азначае цыкл, а T - парог.Прасцей кажучы, значэнне Ct - гэта колькасць цыклаў, якія адпавядаюць моманту, калі пачатковая ампліфікацыя шаблону дасягае пэўнай колькасці прадукту ў КПЦР.Так званая «пэўная колькасць прадукту» будзе растлумачана пазней.

Што робіць значэнне Ct?

1.Сувязь паміж экспанентным узмацненнем, велічынёй шаблону і значэннем Ct
У ідэале гены ў qPCR назапашваюцца шляхам экспанентнай ампліфікацыі пасля пэўнай колькасці цыклаў.Сувязь паміж колькасцю цыклаў ампліфікацыі і колькасцю прадуктаў такая: колькасць узмоцненага прадукту = пачатковая колькасць шаблону × (1+En) колькасць цыклаў.Тым не менш, рэакцыя qPCR не заўсёды бывае ідэальнай.Калі колькасць узмоцненага прадукту дасягае «пэўнай колькасці прадукту», колькасць цыклаў у гэты час з'яўляецца значэннем Ct, і яно знаходзіцца ў перыядзе экспанентнага ўзмацнення.Адносіны паміж значэннем Ct і колькасцю пачатковага шаблону: існуе лінейная залежнасць паміж значэннем Ct шаблону і лагарыфмам нумара пачатковай копіі шаблона.Чым вышэй пачатковая канцэнтрацыя шаблону, тым меншае значэнне Ct;чым ніжэй пачатковая канцэнтрацыя шаблону, тым больш значэнне Ct.

2. Крывая ампліфікацыі, парог флуарэсцэнцыі і пэўная колькасць прадукту ПЦР
Колькасць прадукту ампліфікацыі qPCR непасрэдна прадстаўлена ў выглядзе флуарэсцэнтнага сігналу, гэта значыць крывой ампліфікацыі.На ранняй стадыі ПЦР ампліфікацыя адбываецца ў ідэальных умовах, колькасць цыклаў невялікая, назапашванне прадукту невялікае, і ўзровень флуарэсцэнцыі немагчыма выразна адрозніць ад фону флуарэсцэнцыі.Пасля гэтага флуарэсцэнцыя ўзрастае і пераходзіць у экспанентную фазу.Колькасць прадукту ПЦР можа быць выяўлена ў пэўны момант, калі рэакцыя ПЦР знаходзіцца ў экспанентнай фазе, што можа быць выкарыстана як «пэўная колькасць прадукту», і з гэтага можна вывесці пачатковы змест шаблону.Такім чынам, інтэнсіўнасць сігналу флуарэсцэнцыі, якая адпавядае пэўнай колькасці прадукту, з'яўляецца парогам флуарэсцэнцыі.

На позняй стадыі ПЦР крывая ампліфікацыі больш не паказвае экспанентнага ўзмацнення і пераходзіць у лінейную фазу і фазу плато.

3. Узнаўляльнасць значэнняў Ct
Калі цыкл ПЦР дасягае нумара цыкла значэння Ct, ён толькі што ўвайшоў у сапраўдны перыяд экспанентнай ампліфікацыі.У гэты час невялікая хібнасць не была ўзмоцнена, таму ўзнаўляльнасць значэння Ct выдатная, гэта значыць адзін і той жа шаблон узмацняецца ў розны час або ў розных прабірках адначасова.Узмацненне, атрыманае значэнне Ct пастаяннае.

1. Эфектыўнасць узмацнення En
Эфектыўнасць ПЦР-ампліфікацыі адносіцца да эфектыўнасці, з якой палімераза ператварае ген, які трэба ўзмацніць, у амплікон.Эфектыўнасць ампліфікацыі пры трансфармацыі адной малекулы ДНК у дзве малекулы ДНК складае 100%.Эфектыўнасць узмацнення звычайна выражаецца як En.Для таго, каб палегчыць аналіз наступных артыкулаў, коратка прадстаўлены фактары, якія ўплываюць на эфектыўнасць узмацнення.

2.Дыяпазон значэнняў Ct
Значэнні Ct вагаюцца ў межах 15-35.Калі значэнне Ct менш за 15, лічыцца, што ўзмацненне знаходзіцца ў межах базавага перыяду і парог флуарэсцэнцыі не дасягнуты.У ідэале існуе лінейная залежнасць паміж значэннем Ct і лагарыфмам першапачатковага нумара копіі шаблону, гэта значыць стандартнай крывой.З дапамогай стандартнай крывой, калі эфектыўнасць ампліфікацыі складае 100%, разлічанае значэнне Ct для колькаснага вызначэння колькасці адной копіі гена складае каля 35. Калі яно больш за 35, пачатковая колькасць копій шаблону тэарэтычна меншая за 1, што можна лічыць бессэнсоўным.

Для розных дыяпазонаў Ct гена з-за розніцы ў колькасці копій гена і эфектыўнасці ампліфікацыі ў пачатковай колькасці шаблону неабходна зрабіць стандартную крывую для гена і разлічыць лінейны дыяпазон выяўлення гена.

3. Фактары, якія ўплываюць на значэнне Ct
З залежнасці паміж колькасцю цыклаў ампліфікацыі і колькасцю прадукту: колькасць ампліфікаванага прадукту = колькасць пачатковага шаблону × (1+En) нумар цыкла, відаць, што ў ідэальных умовах колькасць пачатковага шаблону і En будуць мець негатыўны ўплыў на значэнне Ct.Розніца ў якасці шаблону або эфектыўнасці ўзмацнення прывядзе да таго, што значэнне Ct будзе занадта вялікім або занадта малым.

4. Значэнне Ct занадта вялікае або занадта малое