Свінец

Доўгая некадуючая РНК, lncRNA - гэта некадзіруючая РНК даўжынёй больш за 200 нуклеатыдаў, звычайна паміж 200-100000 нуклеатыдаў.lncRNA рэгулюе экспрэсію генаў на эпігенетычным, транскрыпцыйным і посттранскрыпцыйным узроўнях і ўдзельнічае ў сайленсінгу Х-храмасомы, імпрынтынгу геному і мадыфікацыі храмаціну, актывацыі транскрыпцыі, інтэрферэнцыі транскрыпцыі, ядзерным транспарце, рэгуляцыі клеткавага цыклу, рэгуляцыі клетачнай дыферэнцыяцыі і эфектах кампенсацыі дозы (эфект кампенсацыі дазоўкі), а таксама многіх іншых важных працэсах рэгулявання цесна звязаны з узнікненнем, развіццём і прафілактыкай чалавечага хваробы, і ў цяперашні час з'яўляюцца адной з гарачых кропак у галіне біямедыцыны.

01  Тыпы і характарыстыка LncRNA

lncRNA падзяляецца на мноства тыпаў у залежнасці ад розных крыніц яе ўтварэння, як паказана на малюнку вышэй.Мае наступныя характарыстыкі:

1. lncRNA звычайна больш доўгія, з дынамічнай экспрэсіяй і рознымі метадамі сплайсінгу падчас дыферэнцыявання
2. У параўнанні з кадавальнымі генамі, lncRNA звычайна мае больш нізкі ўзровень экспрэсіі
3. Большасць lncRNA маюць відавочную часовую і прасторавую спецыфіку экспрэсіі ў працэсе тканкавай дыферэнцыявання і развіцця
4. Характэрныя выязваўлення пры пухлінах і іншых захворваннях
5. Субклеткавых размяшчэнне lncRNA разнастайныя
6. Паслядоўнасць мае нізкую ступень захаванасці, але функцыя мае пэўную ступень захаванасці і г.д.

02 Часта задаюць пытанні аб зваротнай транскрыпцыі LncRNA

З-за нізкага ўтрымання lncRNA ў клетках, вялікай даўжыні і структуры высокага ўзроўню такая РНК часта мае складаныя структуры, такія як ствалавыя завесы або шпількі, і RT-qPCR схільная праблемам няўдалай зваротнай транскрыпцыі або нізкай эфектыўнасці.

03 Рашэнне зваротнай транскрыпцыі LncRNA

У цэнтральным правіле працэс РНК-вірусаў, якія выкарыстоўваюць сваю ўласную зваротную транскрыптазу для сінтэзу ДНК з выкарыстаннем РНК у якасці шаблону, называецца зваротнай транскрыпцыяй.Працэс выкарыстання зваротнай транскрыптазы РНК-віруса для сінтэзу кДНК-матрыцы in vitro называецца зваротнай транскрыпцыяй.Асноўныя элементы, якія ўваходзяць у сістэму зваротнай транскрыпцыі: матрыца РНК, зваротная транскрыптаза, праймеры і іншыя кампаненты.

1. Шаблон РНК

Уплыў матрыцы РНК на зваротную транскрыпцыю адлюстроўваецца на яе структуры, чысціні і цэласнасці.Чым вышэй чысціня і цэласнасць экстрагаванай РНК, тым вышэй эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі і больш дакладныя наступныя колькасныя вынікі.РНК, ачышчаная звычайнымі рэагентамі для экстракцыі РНК, часта змяшчае рэшткі спірту і гуанідзінавых соляў, якія аказваюць моцны інгібіруючы эфект на большасць зваротных транскрыптаз.

2.Обратная транскриптаза

Зваротная транскрыптаза мае ключавы ўплыў ва ўсёй сістэме зваротнай транскрыпцыі.Прыдатная тэмпература для зваротнай транскрыптазы, якая выкарыстоўваецца ў большасці лабараторый, звычайна складае 42°C.Фактычна, адкрыццё структуры РНК высокага ўзроўню патрабуе больш высокай тэмпературы, і патрабаванні да зваротнай транскрыптазы вышэй.

3.Буквар

Праймеры зваротнай транскрыпцыі ўключаюць ген-спецыфічныя праймеры, выпадковыя праймеры і праймеры Oligo dT.Большасць lncRNA не ўтрымліваюць хвастоў polyA, і важна правільна супаставіць выпадковыя праймеры з Oligo dT.

4.Іншыя кампаненты

У сувязі з тым, што РНК асабліва лёгка расшчапляецца, можна звесці да мінімуму ўвядзенне кампанентаў у сістэму зваротнай транскрыпцыі, якія могуць эфектыўна прадухіліць пранікненне РНКазы і забяспечыць плаўнае праходжанне зваротнай транскрыпцыі.

Fарэгенатрымлівае з матрыцы РНК, зваротнай транскрыпцыі ў qPCR

Ўсебакова суправаджэнне вашага выяўлення lncRNA

Агульная РНК жывёл IсаляцыяНабор (з калонкай для выдалення гДНК)

Агульная РНК клеткі IсаляцыяНабор (з калонкай для выдалення гДНК)

Lnc-RT HeroTM I (з gDNase) (суперпрэмікс для сінтэзу першай ніткі кДНК з lncRNA)

ПЦР у рэальным часе EasyTM-SYBR Green I

Aперавагі ofВылучэнне РНК:

У камплекце выкарыстоўваецца тэхналогія экстракцыі РНК трэцяга пакалення, без неабходнасці выкарыстання ДНКазы.

11 хвілін з культывавання клетак у 96, 24, 12 і 6-лункавых пласцінах, высокаэфектыўная экстракцыя агульнай РНК клетак без гДНК высокай чысціні.

Перавагі зваротнай транскрыпцыі lncRNA:

Сістэма зваротнай транскрыпцыі, спецыяльна распрацаваная для LncRNA для хуткага выдалення забруджвання геномнай ДНК.

Сістэма зваротнай транскрыпцыі мае высокую тэрмічную стабільнасць і па-ранейшаму мае добрую прадукцыйнасць зваротнай транскрыпцыі пры 50°C.

Шаблоны з высокім утрыманнем GC і складанай другаснай структурай могуць быць адменены з высокай эфектыўнасцю.

Перавагіof qПЦР:

Гарачы старт Foregene Taq Polymerase мае больш высокую эфектыўнасць узмацнення, больш высокую адчувальнасць узмацнення і больш высокую спецыфічнасць узмацнення

Аптымізаваная Real PCR Easy Mix робіць SYBR Green I больш высокай адчувальнасцю выяўлення, а яго інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі ў 3-5 разоў перавышае інтэнсіўнасць аналагічных прадуктаў, што можа задаволіць патрэбы розных тыпаў колькасных эксперыментаў па флуарэсцэнцыі.