Страта слыху (HL) з'яўляецца найбольш распаўсюджаным захворваннем сэнсарнай інваліднасці ў людзей.У развітых краінах каля 80% выпадкаў перад'язычнай глухаватасці ў дзяцей выкліканыя генетычнымі фактарамі.Найбольш распаўсюджанымі з'яўляюцца дэфекты аднаго гена (як паказана на мал. 1), 124 мутацыі генаў, як было выяўлена, звязаны з несиндромальной стратай слыху ў людзей, астатнія выкліканы фактарамі навакольнага асяроддзя.Кахлеарны імплантат (электронная прылада, размешчаная ва ўнутраным вуху, якая забяспечвае электрычную стымуляцыю непасрэдна да слыхавога нерва), безумоўна, з'яўляецца найбольш эфектыўным варыянтам для лячэння цяжкай формы HL, у той час як слыхавы апарат (знешняе электроннае прылада, якое пераўтворыць і ўзмацняе гукавыя хвалі) можа дапамагчы пацыентам з HL сярэдняй ступені.Аднак у цяперашні час не існуе лекаў для лячэння спадчыннага HL (GHL).У апошнія гады геннай тэрапіі надаецца ўсё больш увагі як перспектыўнаму падыходу да лячэння дысфункцыі ўнутранага вуха.

Мал.1.Размеркаванне варыяцыйнага тыпу, звязанага з глухатой.[1]

Нядаўна навукоўцы з Інстытута Солка і Універсітэта Шэфілда апублікавалі вынікі даследавання ў Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], якія паказалі шырокія перспектывы прымянення in vivo геннай тэрапіі спадчыннай глухаты.Уры Мэнор, дацэнт Інстытута Солка і дырэктар Цэнтра перадавой біяфатонікі Уэйта, сказаў, што ён нарадзіўся з сур'ёзнай стратай слыху і лічыць, што аднаўленне слыху было б выдатным падарункам.Яго папярэднія даследаванні паказалі, што Eps8 з'яўляецца рэгулятарным бялком актыну з актыўнасцю звязвання і закрыцця актыну;у кахлеарных волосковых клетках бялковы комплекс, утвораны Eps8 з MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 і GNAI3, у асноўным існуе ў большасці кончыкаў доўгіх стэрэацылій, якія разам з MYO15A лакалізуюць BAIAP2L2 на кончыках больш кароткіх стэрэацылій, неабходныя для падтрымання пучкоў валасоў.Такім чынам, Eps8 можа рэгуляваць даўжыню стэрэацылій волосковых клетак, што важна для нармальнай функцыі слыху;Выдаленне або мутацыя Eps8 прывядзе да кароткіх стэрэацылій, якія робяць яго не здольным належным чынам пераўтвараць гук у электрычныя сігналы для ўспрымання мозгам, што, у сваю чаргу, прыводзіць да глухаты..У той жа час, супрацоўнік Walter Marcotti, прафесар Універсітэта Шэфілда, выявіў, што валасяныя клеткі не могуць нармальна развівацца ў адсутнасць Eps8.У гэтым даследаванні Манор і Маркоці аб'ядналіся, каб даследаваць, ці можа даданне Eps8 да стэрэацыліярных клетак аднавіць іх функцыі і, у сваю чаргу, палепшыць слых у мышэй.Даследчая група выкарыстала вектар Anc80L65 адэнаасацыяванага віруса (AAV), каб даставіць кадзіруючую паслядоўнасць, якая змяшчае EPS8 дзікага тыпу, у слімаку Eps8-/- нованароджаных мышэй P1-P2 шляхам ін'екцыі мембраны круглага акна;у кахлеарных волосковых клетках мышэй Функцыя стэрэацылій аднаўлялася да таго, як яны паспелі;і эфект аднаўлення характарызаваўся тэхналогіяй візуалізацыі і вымярэннем стэрэацылій.Вынікі паказалі, што Eps8 павялічыў даўжыню стэрэацылій і аднавіў функцыю волосковых клетак у нізкачашчынных клетках.Яны таксама выявілі, што з цягам часу клеткі, здавалася, губляюць здольнасць быць выратаванымі гэтай геннай тэрапіяй.Маецца на ўвазе тое, што такое лячэнне можа спатрэбіцца ўнутрычэраўна, паколькі валасяныя клеткі Eps8-/- маглі саспець або назапасіць пашкоджанні, якія немагчыма аднавіць пасля нараджэння мышэй.«Eps8 - гэта бялок з многімі рознымі функцыямі, і яшчэ трэба шмат чаго даследаваць», - сказаў Манор.Будучыя даследаванні будуць уключаць вывучэнне эфекту геннай тэрапіі Eps8 на аднаўленне слыху на розных стадыях развіцця і ці магчыма падоўжыць магчымасці лячэння.Па супадзенні, у лістападзе 2020 года прафесар Карэн Б. Аўраам з Тэль-Авіўскага ўніверсітэта ў Ізраілі апублікаваў свае вынікі ў часопісе EMBO Molecular Medicine [3], выкарыстоўваючы інавацыйную тэхналогію геннай тэрапіі для стварэння бясшкоднага сінтэтычнага аденоассоциированного віруса AAV9-PHP.Б. Генны дэфект у валасяных клетках мышэй Syne4-/- быў выпраўлены шляхам ін'екцыі віруса, які нясе кадавальную паслядоўнасць Syne4, ва ўнутранае вуха мышэй, што дазволіла яму пранікнуць у валасяныя клеткі і вызваліць перанесены генетычны матэрыял, дазваляючы ім сталець і нармальна функцыянаваць (як на мал. 2).

Мал.2.Схематычнае адлюстраванне анатоміі ўнутранага вуха з акцэнтам на корціеў орган і клеткавую функцыю неспрын-4.

Можна заўважыць, што выкарыстанне геннай тэрапіі для дасягнення мэты лячэння спадчынных захворванняў на генным узроўні шляхам устаўкі, выдалення або карэкцыі любых мутаваных генаў для лячэння (гэта значыць кантролю генетычных змен у захворванні) мае высокі клінічны эфект.перспектывы прымянення.Сучасныя метады геннай тэрапіі генетычна дэфіцытнай глухаты можна падзяліць на наступныя катэгорыі:

замена гена

Замена гена, магчыма, з'яўляецца самай «простай» формай геннай тэрапіі, заснаванай на ідэнтыфікацыі і замене дэфектнага гена нармальнай або дзікай копіяй гена.Першае паспяховае даследаванне геннай тэрапіі ўнутранага вуха для страты слыху, выкліканай выдаленнем гена везікулярнага транспарцёра глутамата 3 (VGLUT3);Апасродкаваная AAV1 дастаўка экзагеннай празмернай экспрэсіі VGLUT3 у волосковых клетках унутранага вуха (IHC) можа прывесці да ўстойлівага аднаўлення слыху, частковага аднаўлення сінаптычнай марфалогіі стужкі і сутаргавых рэакцый [4].Аднак у прыкладах, уключаючы дзве замены гена, якія дастаўляюцца AAV, апісаныя ва ўводзінах вышэй, важна адзначыць, што мышыныя мадэлі, якія выкарыстоўваюцца для пэўных тыпаў спадчынных расстройстваў страты слыху з выдаленнем генаў, часова адрозніваюцца ад чалавечых, і ў мышэй P1 унутранае вуха знаходзіцца ў спелай стадыі развіцця.Наадварот, людзі нараджаюцца са сталым унутраным вухам.Гэтая розніца прадухіляе магчымае прымяненне вынікаў даследаванняў на мышах для лячэння спадчынных парушэнняў глухаты ў чалавека, калі толькі генная тэрапія не праводзіцца ў спелых вушах мышы.

Рэдагаванне генаў: CRISPR/Cas9

У параўнанні з «заменай генаў», развіццё тэхналогіі рэдагавання генаў прывяло да пачатку лячэння генетычных захворванняў ад кораня.Важна адзначыць, што метад рэдагавання генаў кампенсуе недахопы традыцыйных метадаў геннай тэрапіі празмернай экспрэсіі, якія не падыходзяць для лячэння дамінантнай спадчыннай глухаты, а таксама праблему, што метад гіперэкспрэсіі не дзейнічае доўга.Пасля таго, як кітайскія даследчыкі спецыяльна выбілі мутантны алель Myo6C442Y у мышэй Myo6WT/C442Y з дапамогай сістэмы рэдагавання генаў AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, і на працягу 5 месяцаў пасля накаўту, мышы. Слыхавая функцыя мадэлі была адноўлена;у той жа час было таксама заўважана, што выжывальнасць волосковых клетак ва ўнутраным вуху была палепшана, форма вейчыкаў стала правільнай, і электрафізіялагічныя паказчыкі былі скарэкціраваны [5].Гэта першае ў свеце даследаванне з выкарыстаннем тэхналогіі CRISPR/Cas9 для лячэння спадчыннай глухаты, выкліканай мутацыяй гена Myo6, і гэта важны прагрэс у даследаванні тэхналогіі рэдагавання генаў для лячэння спадчыннай глухаты.Клінічны пераклад лячэння забяспечвае трывалую навуковую аснову.

Метады геннай тэрапіі

Каб генная тэрапія была паспяховай, голыя малекулы ДНК не могуць эфектыўна пранікаць у клеткі з-за іх гідрафільнасці і адмоўнага зарада фасфатных груп, і для забеспячэння цэласнасці малекул нуклеінавых кіслот з дадаткам неабходна выбраць бяспечны і эфектыўны метад.Дапоўненая ДНК дастаўляецца ў клетку-мішэнь або тканіну.AAV шырока выкарыстоўваецца ў якасці сродку дастаўкі для лячэння захворванняў з-за яго высокага інфекцыйнага эфекту, нізкай імунагеннасці і шырокай тропностью да розных тыпаў тканін.У цяперашні час вялікі аб'ём даследчых работ вызначыў трапізм розных падтыпаў AAV адносна розных тыпаў клетак у слімаку мышы.Выкарыстанне характарыстык дастаўкі AAV у спалучэнні з клетачна-спецыфічнымі прамотарамі можа дасягнуць клеткава-спецыфічнай экспрэсіі, што можа паменшыць нецэлевыя эфекты.Акрамя таго, у якасці альтэрнатывы традыцыйным вектарам AAV пастаянна распрацоўваюцца новыя сінтэтычныя вектары AAV, якія дэманструюць цудоўную здольнасць трансдукцыі ва ўнутраным вуху, з якіх найбольш шырока выкарыстоўваецца AAV2/Anc80L65.Невірусныя метады дастаўкі можна падзяліць на фізічныя (мікраін'екцыя і электрапарацыя) і хімічныя (наначасціцы на аснове ліпідаў, палімераў і золата).Абодва падыходы выкарыстоўваліся ў лячэнні спадчынных парушэнняў глухаты і паказалі розныя перавагі і абмежаванні.У дадатак да сродку дастаўкі геннай тэрапіі ў якасці носьбіта можна выкарыстоўваць розныя падыходы да ўвядзення генаў in vivo на аснове розных тыпаў клетак-мішэняў, шляхоў увядзення і тэрапеўтычнай эфектыўнасці.Складаная структура ўнутранага вуха абцяжарвае доступ да клетак-мішэняў, а распаўсюджванне агентаў для рэдагавання геному адбываецца павольна.Перапончаты лабірынт размешчаны ў касцяным лабірынце скроневай косткі і ўключае ўлікавы пратока, паўкруглы пратока, матку і балон.Яго адносная ізаляцыя, мінімальная лімфатычная цыркуляцыя і аддзяленне ад крыві бар'ерам з крывяным лабірынтам абмяжоўваюць эфектыўную сістэмную дастаўку тэрапеўтычных сродкаў толькі нованароджаным мышам.Каб атрымаць тытры віруса, прыдатныя для геннай тэрапіі, неабходна прамая мясцовая ін'екцыя вірусных вектараў ва ўнутранае вуха.Устаноўленыя шляхі ін'екцыі ўключаюць [6]: (1) мембрана з круглым акном (RWM), (2) трахеатамія, (3) эндалімфатычная або перылімфатычная кахлеастамія, (4) мембрана з круглым акном плюс фенестрацыя трубкі (CF) (як на мал. 3).

Мал.3.Дастаўка геннай тэрапіі ўнутранага вуха.

Нягледзячы на ​​​​тое, што ў геннай тэрапіі было дасягнута шмат поспехаў, заснаваных на мэтах клінічнай трансляцыі, неабходна яшчэ папрацаваць, перш чым генная тэрапія можа стаць метадам лячэння першай лініі для пацыентаў з генетычнымі захворваннямі, асабліва ў распрацоўцы бяспечных і эфектыўных вектараў і спосабаў дастаўкі.Але мы верым, што ў недалёкай будучыні гэтыя віды лячэння стануць адным з асноўных элементаў персаналізаванай тэрапіі і акажуць надзвычай станоўчы ўплыў на жыццё людзей з генетычнымі парушэннямі і іх сем'яў.

Foregene таксама выпусціла высокапрадукцыйны скрынінгавы набор для мэтавых генаў, які працуе хутка і можа выконваць рэакцыі зваротнай транскрыпцыі і кПЦР без экстракцыі РНК.

Спасылкі на прадукт

Набор Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Для атрымання дадатковай інфармацыі аб прадукце, калі ласка, звяжыцеся з:

overseas@foregene.com