Тэхналогія малекулярнай дыягностыкі выкарыстоўвае метады малекулярнай біялогіі для выяўлення экспрэсіі і структуры генетычнага матэрыялу чалавечага цела і розных узбуджальнікаў, каб дасягнуць мэты прагназавання і дыягностыкі захворванняў.

У апошнія гады з мадэрнізацыяй і ітэрацыяй тэхналогіі малекулярнай дыягностыкі клінічнае прымяненне малекулярнай дыягностыкі становіцца ўсё больш і больш шырокім і глыбокім, і рынак малекулярнай дыягностыкі ўступіў у перыяд хуткага развіцця.

Аўтар абагульняе агульныя тэхналогіі малекулярнай дыягностыкі на рынку і падзелены на тры часткі: першая частка прадстаўляе тэхналогію ПЦР, другая частка прадстаўляе тэхналогію ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот, а другая частка прадстаўляе тэхналогію секвенирования.

01

Частка I: Тэхналогія ПЦР

Тэхналогія ПЦР

ПЦР (палімеразная ланцуговая рэакцыя) - адна з тэхналогій in vitro ампліфікацыі ДНК, гісторыя якой налічвае больш за 30 гадоў.

Тэхналогія ПЦР была ўпершыню ўведзена ў 1983 годзе Кэры Мулісам з горада Сетус, ЗША.Маліс падаў заяўку на патэнт на ПЦР у 1985 годзе і ў тым жа годзе апублікаваў першую акадэмічную працу па ПЦР па навуцы.Маліс атрымаў Нобелеўскую прэмію па хіміі ў 1993 годзе.

Асноўныя прынцыпы ПЦР

ПЦР можа ўзмацніць мэтавыя фрагменты ДНК больш чым у мільён разоў.Прынцып заключаецца ў тым, што пры каталізе ДНК-палімеразы бацькоўскі ланцуг ДНК выкарыстоўваецца ў якасці матрыцы, а спецыфічны праймер выкарыстоўваецца ў якасці адпраўной кропкі для падаўжэння.Ён прайграваецца ў прабірцы праз такія этапы, як дэнатурацыя, адпал і пашырэнне.Працэс даччынай ланцуга ДНК, камплементарны матрычнай ДНК бацькоўскага ланцуга.

Стандартны працэс ПЦР дзеліцца на тры этапы:

1. Дэнатурацыя: выкарыстоўвайце высокую тэмпературу для падзелу двайных ланцугоў ДНК.Вадародныя сувязі паміж падвойнымі ланцугамі ДНК разрываюцца пры высокай тэмпературы (93-98°C).

2. Адпал: пасля аддзялення двухцепочечной ДНК тэмпературу паніжаюць, каб праймер мог звязацца з адналанцуговай ДНК.

3. Пашырэнне: ДНК-палімераза пачынае сінтэзаваць камплементарныя ніткі ўздоўж нітак ДНК з праймераў, звязаных пры паніжэнні тэмпературы.Калі падаўжэнне завершана, цыкл завяршаецца, і колькасць фрагментаў ДНК падвойваецца.

Паўтарыўшы гэтыя тры этапы 25-35 разоў, колькасць фрагментаў ДНК будзе павялічвацца ў геаметрычнай прагрэсіі.

Вынаходлівасць ПЦР заключаецца ў тым, што розныя праймеры могуць быць распрацаваны для розных генаў-мішэняў, так што фрагменты гена-мішэні могуць быць узмацнены за кароткі прамежак часу.

Пакуль ПЦР можна падзяліць на тры катэгорыі, а менавіта звычайную ПЦР, флуоресцентную колькасную ПЦР і лічбавую ПЦР.

Звычайная ПЦР першага пакалення

Выкарыстоўвайце звычайны прыбор для ампліфікацыі ПЦР для ампліфікацыі гена-мішэні, а затым выкарыстоўвайце электрафарэз у агарозным гелі для выяўлення прадукту, можна зрабіць толькі якасны аналіз.

Асноўныя недахопы ПЦР першага пакалення:

-Схільнасць да неспецыфічнага ўзмацнення і прытворнададатных вынікаў.

-Выяўленне займае шмат часу і аперацыя грувасткая.

-Можна правесці толькі якасную праверку.

Флуарэсцэнтная колькасная ПЦР другога пакалення

Флуарэсцэнтная колькасная ПЦР (ПЦР у рэальным часе), таксама вядомая як qPCR, выкарыстоўваецца для маніторынгу назапашвання ампліфікаваных прадуктаў праз назапашванне флуоресцентных сігналаў шляхам дадання флуоресцентных зондаў, якія могуць паказваць ход рэакцыйнай сістэмы, і для ацэнкі вынікаў па крывой флуарэсцэнцыі, і яе можна вызначыць колькасна з дапамогай значэння Cq і стандартнай крывой.

Паколькі тэхналогія кПЦР праводзіцца ў закрытай сістэме, верагоднасць заражэння зніжаецца, а сігнал флуарэсцэнцыі можна кантраляваць для колькаснага выяўлення, таму яна найбольш шырока выкарыстоўваецца ў клінічнай практыцы і стала дамінуючай тэхналогіяй у ПЦР.

Флуарэсцэнтныя рэчывы, якія выкарыстоўваюцца ў флуоресцентной колькаснай ПЦР у рэальным часе, можна падзяліць на: флуоресцентные зонды TaqMan, малекулярныя маякі і флуоресцентные фарбавальнікі.

1) Флуарэсцэнтны зонд TaqMan:

Падчас ПЦР-ампліфікацыі пры даданні пары праймераў дадаецца спецыфічны флуоресцентный зонд.Зонд уяўляе сабой алігануклеатыд, і два канцы адпаведна пазначаны рэпарцёрнай флуоресцентной групай і тушыцельнай флуоресцентной групай.

Калі зонд цэлы, флуоресцентный сігнал, выпраменьваны групай рэпарцёраў, паглынаецца групай тушэння;падчас ПЦР-ампліфікацыі экзануклеазная актыўнасць 5'-3' фермента Taq расшчапляе і разбурае зонд, робячы рэпарцёрную флуоресцентную групу і тушыцель. Флуарэсцэнтная група аддзяляецца, каб сістэма маніторынгу флуарэсцэнцыі магла прымаць сігнал флуарэсцэнцыі, гэта значыць кожны раз, калі ланцужок ДНК узмацняецца, утвараецца флуоресцентная малекула, і адбываецца назапашванне сігналу флуарэсцэнцыі цалкам сінхранізуецца з адукацыяй прадукту ПЦР.

2) Флуарэсцэнтныя фарбавальнікі SYBR:

У рэакцыйную сістэму ПЦР дадаецца лішак флуоресцентного фарбавальніка SYBR.Пасля таго, як флуарэсцэнтны фарбавальнік SYBR неспецыяльна ўключаны ў двухланцуговую ДНК, ён выпраменьвае флуарэсцэнтны сігнал.Малекула фарбавальніка SYBR, якая не ўключана ў ланцужок, не будзе выпраменьваць флуарэсцэнтны сігнал, тым самым забяспечваючы флуарэсцэнтны сігнал. Павелічэнне колькасці прадуктаў ПЦР цалкам сінхранізавана з павелічэннем прадуктаў ПЦР.SYBR звязваецца толькі з двухцепочечной ДНК, таму крывую плаўлення можна выкарыстоўваць, каб вызначыць, ці з'яўляецца рэакцыя ПЦР спецыфічнай.

3) Малекулярныя маякі

Гэта двойчы пазначаны олигонуклеотидный зонд з пятлёй сцябла, які ўтварае шпількавую структуру прыкладна з 8 асноў на 5 і 3 канцах.Паслядоўнасці нуклеінавых кіслот на абодвух канцах з'яўляюцца камплементарна спаранымі, у выніку чаго флуарэсцэнтная група і тушаючая група становяцца цеснымі.Зачыніць, ён не будзе вырабляць флуарэсцэнцыі.

Пасля генерацыі прадукту ПЦР падчас працэсу адпалу сярэдняя частка малекулярнага маяка спалучаецца з пэўнай паслядоўнасцю ДНК, а флуоресцентный ген аддзяляецца ад гена тушыцеля для атрымання флуарэсцэнцыі.

Асноўныя недахопы ПЦР другога пакалення:

Адчувальнасць па-ранейшаму недастатковая, і выяўленне малакопійных узораў недакладнае.

Існуе ўплыў фонавых значэнняў, і вынік успрымальны да перашкод.

Лічбавая ПЦР трэцяга пакалення

Лічбавая ПЦР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) разлічвае колькасць копій мэтавай паслядоўнасці шляхам выяўлення канчатковай кропкі і можа выконваць дакладнае абсалютнае колькаснае выяўленне без выкарыстання ўнутранага кантролю і стандартных крывых.

Лічбавая ПЦР выкарыстоўвае выяўленне канчатковай кропкі і не залежыць ад значэння Ct (парог цыклу), таму на лічбавую ПЦР-рэакцыю менш ўплывае эфектыўнасць ампліфікацыі, а талерантнасць да інгібітараў ПЦР-рэакцыі паляпшаецца з высокай дакладнасцю і ўзнаўляльнасцю.

Дзякуючы асаблівасцям высокай адчувальнасці і высокай дакладнасці, інгібітары ПЦР-рэакцыі не так лёгка ўмешваюцца ў яго, і ён можа дасягнуць сапраўднага абсалютнага колькаснага вызначэння без стандартных прадуктаў, што стала гарачай кропкай даследаванняў і прымянення.

У залежнасці ад розных формаў рэакцыйнага блока, яго можна падзяліць на тры тыпу: мікрафлюідныя, чыпавыя і кропельныя сістэмы.