Прамая ПЦР - гэта рэакцыя, якая непасрэдна выкарыстоўвае тканіны жывёл або раслін для ампліфікацыі без экстракцыі нуклеінавых кіслот.Шмат у чым прамая ПЦР працуе як звычайная ПЦР

Асноўнае адрозненне заключаецца ў спецыяльным буферы, які выкарыстоўваецца ў прамой ПЦР, узор можа быць непасрэдна падвергнуты рэакцыі ПЦР без экстракцыі нуклеінавых кіслот, але існуюць адпаведныя патрабаванні да талерантнасці ферментаў і сумяшчальнасці буфера, які ўдзельнічае ў рэакцыі прамой ПЦР.

Нягледзячы на ​​​​тое, што ў звычайных пробах прысутнічае больш ці менш інгібітараў ПЦР, прамая ПЦР можа дамагчыся надзейнай ампліфікацыі пад дзеяннем ферментаў і буфераў.Традыцыйная рэакцыя ПЦР патрабуе высакаякаснай нуклеінавай кіслаты ў якасці матрыцы, якая можа перашкаджаць плаўнаму праходжанню рэакцыі ПЦР, калі матрыца змяшчае вавёркі і іншыя прымешкі.Прамая ПЦР на дадзены момант з'яўляецца адной з самых папулярных тэхналогій у галіне малекулярнай дыягностыкі.

01 Прамая ПЦР першапачаткова выкарыстоўвалася для жывёл і раслін

Самае ранняе прымяненне прамой ПЦР знаходзіцца ў галіне жывёл і раслін, такіх як кроў, тканіны і поўсць пацукоў, котак, курэй, трусоў, авечак, буйной рагатай жывёлы і г.д., лісце і насенне раслін і г.д., якія выкарыстоўваюцца для вывучэння генатыпу, трансгеннасці, выяўлення плазмід, аналізу накаўту генаў, ідэнтыфікацыі крыніцы ДНК, ідэнтыфікацыі відаў, аналізу SNP і іншых галінах.

Гэтыя палі маюць некаторыя агульныя рысы, гэта значыць, утрыманне гена-мішэні адносна высокае, а экстракцыя нуклеінавых кіслот складаная, таму прамая ПЦР можа не толькі зэканоміць час і аказаць нязначны ўплыў на вынікі, але і зэканоміць выдаткі.

Прамая ПЦР, якая выкарыстоўваецца для выяўлення ўзбуджальнікаў, з'яўляецца справай апошніх гадоў, некаторыя вытворцы ПЦР-рэагентаў прыклалі шмат намаганняў у гэтым кірунку, робячы інавацыі.Асабліва падчас гэтай эпідэміі COVID-19 на рынку з'явілася шмат такіх прадуктаў для выяўлення, такіх як набор для выяўлення нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 (метад мультыплекснага ПЦР з флуоресцентным зондам), даследаваны і распрацаваны Foregene, які выкарыстоўвае тэхналогію ПЦР у рэжыме рэальнага часу (rRT-PCR) для якаснага выяўлення нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 у насаглотцы або роце чалавека. ўзоры мазка з надноснай вобласці.

Foregene - адна з кампаній, якая выкарыстоўвае тэхналогію Direct PCR для выяўлення нармальных ORF1ab, N, E іварыянт лініі нуклеінавых кіслот ва ўзорах мазкоў з насаглоткі і ротаглоткі чалавека, такіх як лінія SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Вялікабрытанія), лінія B.1.351 (ZA), лінія B.1.617 (IND) і лінія P.1 (BR).

02  Рэагенты, неабходныя для прамой ПЦР

Узор лізата

Узор лизата можна наладзіць самастойна або набыць.Розніца ў складзе розных марак лізату зробіць здольнасць лізаваць рознай, і тады час лізавання будзе крыху адрознівацца.Напрыклад, для падрыхтоўкі ўзораў тканак жывёл звычайна рэкамендуецца 30-хвілінны або начны лізіс, а лізіс раствора для вірусаў складае ад 3-10 хвілін.

Майстар-мікс ПЦР

Рэкамендуецца выкарыстоўваць ДНК-палімеразу гарачага старту для ўзмацнення спецыфічнай ампліфікацыі і павышэння здольнасці да ампліфікацыі.Ядром прамой ПЦР з'яўляецца высокаталерантная палімераза.

Выключыце або інгібіруйце кампаненты ўзору, якія ўплываюць на ампліфікацыю ДНК

Пасля апрацоўкі ўзору лізатам вавёркі, ліпіды і іншыя рэшткі клетак будуць вызвалены, гэтыя рэчывы будуць інгібіраваць рэакцыю ПЦР.Такім чынам, прамая ПЦР патрабуе дадання адпаведнага выдалення або інгібітараў, каб паменшыць уплыў гэтых фактараў.

03  Калекцыя з пяці пунктаў ведаў прамой ПЦР

Па-першае, тэхналогія Direct PCR - гэта тэхналогія прамой ПЦР для розных біялагічных узораў.У адпаведнасці з гэтым тэхнічным умовай няма неабходнасці аддзяляць і здабываць нуклеінавую кіслату, непасрэдна выкарыстоўваць узор тканіны ў якасці аб'екта і дадаваць праймеры мэтавага гена для выканання рэакцыі ПЦР.

Па-другое, тэхналогія Direct PCR - гэта не толькі традыцыйная тэхналогія ампліфікацыі шаблону ДНК, але таксама ўключае ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй шаблону РНК.

Па-трэцяе, тэхналогія Direct PCR не толькі непасрэдна выконвае звычайныя якасныя рэакцыі ПЦР на ўзорах тканін, але таксама ўключае рэакцыі кПЦР у рэальным часе, што патрабуе, каб рэакцыйная сістэма мела моцную здольнасць супраць фонавых флуарэсцэнтных перашкод, а эндагенная флуарэсцэнцыя гашыла антаганістычную здольнасць.

Па-чацвёртае, узорам, якія ахопліваюць тэхналогію Direct PCR, патрабуецца толькі вызваленне шаблонаў нуклеінавых кіслот і не выдаляюцца вавёркі, поліцукрыды, іёны соляў і г.д., якія перашкаджаюць рэакцыі ПЦР.Што патрабуе ад палімеразы нуклеінавых кіслот і сумесі ПЦР у рэакцыйнай сістэме выдатнай устойлівасці і здольнасці да адаптацыі для забеспячэння актыўнасці ферментаў і дакладнасці рэплікацыі ў складаных умовах.

Па-пятае, узор тканіны, на які нацэльваецца тэхналогія Direct PCR без узбагачэння нуклеінавых кіслот, і колькасць шаблону вельмі малыя, што патрабуе ад рэакцыйнай сістэмы надзвычай высокай адчувальнасці і эфектыўнасці ампліфікацыі.