Я лічу, што кожны заўсёды будзе сутыкацца з тымі ці іншымі праблемамі пры ПЦР-рэакцыі, але большасць з іх можна падзяліць на дзве асноўныя праблемы:

Занадта малая ампліфікацыя шаблону гена (ампліфікацыя);
Занадта моцная ампліфікацыя нямэтавага гена.
Выкарыстанне дабавак - адна з распаўсюджаных стратэгій вырашэння гэтых праблем.Звычайна роля дабавак мае два аспекты:
другасная структурагенаў (другасная структура);
Паменшыце неспецыфічную грунтоўку.
Сёння рэдактар ​​коратка пазнаёміць вас з агульнымі дадаткамі ў рэакцыях ПЦР і іх функцыямі.
Дабаўкі, якія зніжаюць другасную структуру
сульфоксид(DMSO)
ўзоры генаўз высокім утрыманнем GC.Аднак ДМСО таксама значна зніжае актыўнасць палімеразы Taq.Такім чынам, кожны павінен збалансаваць даступнасць шаблону і актыўнасць палімеразы.Рэдактар ​​мяркуе, што вы можаце паспрабаваць розныя канцэнтрацыі DSMO, напрыклад, ад 2% да 10%, каб знайсці канцэнтрацыю, якая адпавядае вашаму эксперыменту.
Неіённыя мыйныя сродкі
Неіённыя мыйныя сродкі, такія як 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 або NP-40, звычайна зніжаюць другасную структуру ДНК.Нягледзячы на ​​тое, што гэта можа павялічыць ампліфікацыю шаблоннага гена, гэта таксама выкліча праблемы з неспецыфічнай ампліфікацыяй.Такім чынам, гэтыя дадаткі добра працуюць для рэакцый ПЦР з нізкім ураджаем без смецця, але не вельмі добра для рэакцый ПЦР з адноснай забруджанасцю.Яшчэ адна перавага неіённых мыйных сродкаў - памяншэнне забруджвання SDS.Звычайна ў працэсе экстракцыі ДНК SDS пераходзіць на стадыю ПЦР, што значна інгібіруе актыўнасць палімеразы.Такім чынам, даданне ў рэакцыю 0,5% Tween-20 або Tween-40 можа нейтралізаваць негатыўнае ўздзеянне SDS.
Бэтаін_
Бэтаін можа палепшыць ампліфікацыю ДНК за кошт памяншэння адукацыі другаснай структуры і звычайна з'яўляецца «таямнічым» дадаткам да камерцыйных набораў ПЦР.Калі вы хочаце выкарыстоўваць бэтаін, вы павінны пакласці бэтаін або бэтаін монагідрат (Бэтаін або Бэтаін моногідрат), але не бэтаін гідрахларыд (Бэтаін HCl), давядзіце да канчатковай канцэнтрацыі 1-1,7 М.Бэтаін можа таксама дапамагчы палепшыць спецыфічнасць, таму што ён ліквідуе залежнасць ад складу пары асноў расплаўлення ДНК/дэнатурацыі ДНК.
Дабаўкі для памяншэння неспецыфічнага грунтавання
Формамід
Формамід - звычайна выкарыстоўваная арганічная ПЦР-дабаўка.Ён можа спалучацца з вялікай і малой баразёнкамі ў ДНК, тым самым зніжаючы стабільнасць двайной спіралі галоўнай ДНК і зніжаючы тэмпературу плаўлення ДНК.Канцэнтрацыя формамида, які выкарыстоўваецца ў эксперыментах ПЦР, звычайна складае 1%-5%.
Тэтраметылхларыд амонія( TMAC)
Хларыд тетраметиламмония можа павысіць спецыфічнасць гібрыдызацыі (спецыфічнасць гібрыдызацыі) і павялічыць тэмпературу плаўлення ДНК.Такім чынам, TMAC можа выдаліць неспецыфічны праймінг і паменшыць няправільнае звязванне ДНК і РНК.Калі вы выкарыстоўваецевыраджаюцца букварыу рэакцыі ПЦР не забудзьцеся дадаць TMAC, які звычайна выкарыстоўваецца ў канцэнтрацыі 15-100 мМ.
Іншыя распаўсюджаныя дадаткі
У дадатак да дзвюх катэгорый дабавак, згаданых вышэй, у рэакцыях ПЦР існуе мноства агульных дабавак, якія, хоць і выконваюць розныя функцыі, таксама вельмі важныя.
Іён магнію
Іён магнію з'яўляецца незаменным кофактором (кафактар) палімеразы, гэта значыць без іёна магнію палімераза неактыўная.Аднак занадта вялікая колькасць іёнаў магнію таксама можа паўплываць на эфектыўнасць палімеразы.Канцэнтрацыя іёнаў магнію ў кожнай рэакцыі ПЦР будзе адрознівацца.Хелатирующие агенты (напрыклад, ЭДТА або цытрат), канцэнтрацыя dNTP і бялкоў - усё гэта ўплывае на канцэнтрацыю іёнаў магнію.Такім чынам, калі ў вас узніклі праблемы з эксперыментам ПЦР, вы можаце паспрабаваць змяніць розныя канцэнтрацыі іёнаў магнію, напрыклад, ад 1,0 да 4,0 ммоль з інтэрвалам 0,5–1 ммоль паміж імі.
Варта адзначыць, што некалькі цыклаў замарожвання-адтавання могуць прывесці да канцэнтрацыйнага расслаення раствора хларыду магнію.Такім чынам, вы павінны цалкам растварыць яго перад кожным выкарыстаннем і добра змяшаць перад ужываннем.
Сыроватачны альбумін буйной рагатай жывёлы(Бычыны альбумін, BSA)
У эксперыментах па малекулярнай хіміі бычыны сыроватачны альбумін з'яўляецца вельмі распаўсюджанай дадаткам, асабліва ў эксперыментах па расшчапленні ферментамі рэстрыкцыі і ПЦР.У рэакцыях ПЦР BSA дапамагае паменшыць забруджванні, такія як фенольныя злучэнні.І таксама кажуць, што гэта можа паменшыць адгезію рэагентаў да сценкі прабіркі.У рэакцыі ПЦР звычайна канцэнтрацыя дададзенага БСА можа дасягаць 0,8 мг/мл.
 
Спадарожныя тавары:
Герой ПЦР(з фарбавальнікам)
Герой ПЦР