1. Базавыя веды (калі вы хочаце ўбачыць эксперыментальную частку, перайдзіце непасрэдна да другой часткі)
З'яўляючыся вытворнай рэакцыяй звычайнай ПЦР, ПЦР у рэальным часе ў асноўным кантралюе змяненне колькасці прадукту ампліфікацыі ў кожным цыкле рэакцыі ампліфікацыі ПЦР у рэжыме рэальнага часу праз змяненне сігналу флуарэсцэнцыі і колькасна аналізуе пачатковы шаблон праз залежнасць паміж значэннем ct і стандартнай крывой.
Спецыфічныя дадзеныя RT-PCRбазавая лінія, парог флуарэсцэнцыііЗначэнне Ct.
| базавая лінія: | Значэнне флуарэсцэнцыі 3-га-15-га цыклаў з'яўляецца базавым (базавым), якое выклікана выпадковай памылкай вымярэння. |
| Парог (парог): | Адносіцца да мяжы выяўлення флуарэсцэнцыі, усталяванай у адпаведным месцы ў вобласці экспанентнага росту крывой ампліфікацыі, звычайна ў 10 разоў больш стандартнага адхілення ад базавай лініі. |
| значэнне CT: | Гэта колькасць цыклаў ПЦР, калі значэнне флуарэсцэнцыі ў кожнай рэакцыйнай прабірцы дасягае парогавага значэння. Значэнне Ct зваротна прапарцыйна колькасці пачатковага шаблону. |
Агульныя метады маркіроўкі для RT-PCR:
| метад | перавага | недахоп | сфера прымянення |
| SYBR GreenⅠ | Шырокае прымяненне, адчувальны, танны і зручны | Патрабаванні да праймераў высокія, схільныя да неспецыфічных палос | Ён падыходзіць для колькаснага аналізу розных генаў-мішэняў, даследаванняў экспрэсіі генаў і даследаванняў трансгенных рэкамбінантных жывёл і раслін. |
| TaqMan | Добрая спецыфічнасць і высокая паўтаранасць | Кошт высокая і падыходзіць толькі для канкрэтных мэтаў. | Выяўленне ўзбуджальнікаў, даследаванне генаў лекавай устойлівасці, ацэнка эфектыўнасці лекаў, дыягностыка генетычных захворванняў. |
| малекулярны маяк | Высокая спецыфічнасць, флуарэсцэнцыя, нізкі фон | Кошт высокая, падыходзіць толькі для пэўнай мэты, канструкцыя складаная, а кошт высокая. | Спецыфічны генны аналіз, аналіз SNP |
2. Эксперыментальныя этапы
2.1 Аб эксперыментальнай групоўцы- у групе павінна быць некалькі лунак і павінны быць біялагічныя паўторы.
| ① | Пусты кантроль | Выкарыстоўваецца для вызначэння стану росту клетак у эксперыментах |
| ② | МіРНК адмоўнага кантролю (неспецыфічная паслядоўнасць миРНК) | Прадэманстраваць спецыфіку дзеяння RNAi.siRNA можа выклікаць неспецыфічны адказ на стрэс пры канцэнтрацыі 200 нМ. |
| ③ | Кантроль рэагентаў для трансфекцыі | Выключыць таксічнасць трансфекционного рэагента для клетак або ўплыў на экспрэсію гена-мішэні |
| ④ | миРНК супраць гена-мішэні | Збіце экспрэсію мэтавага гена |
| ⑤ (неабавязкова) | станоўчая миРНК | Выкарыстоўваецца для ліквідацыі непаладак эксперыментальнай сістэмы і эксплуатацыйных праблем |
| ⑥ (неабавязкова) | Флуарэсцэнтны кантроль миРНК | Эфектыўнасць трансфекцыі клетак можна назіраць з дапамогай мікраскопа |
2.2 Прынцыпы пабудовы грунтоўкі
| Павялічаны памер фрагмента | Пажадана на 100-150bp |
| Праймер Даўжыня | 18-25 п.н |
| Змест GC | 30%-70%, пераважна 45%-55% |
| Значэнне Tm | 58-60 ℃ |
| Паслядоўнасць | Пазбягайце бесперапыннага T/C;A/G бесперапынны |
| 3 канцавая паслядоўнасць | Пазбягайце GC rich або AT rich;канцавое падстава пераважна G або C;лепш пазбягаць Т |
| Камплементарнасць | Пазбягайце камплементарных паслядоўнасцей з больш чым 3 асноў у праймеры або паміж двума праймерамі |
| Спецыфіка | Каб пацвердзіць спецыфічнасць праймера, выкарыстоўвайце выбуховы пошук |
①SiRNA відаспецыфічная, і паслядоўнасці розных відаў будуць рознымі.
②SiRNA расфасаваны ў ліафілізаваны парашок, які можна стабільна захоўваць 2-4 тыдні пры пакаёвай тэмпературы.
2.3 Інструменты або рэактывы, якія неабходна падрыхтаваць загадзя
| Буквар (унутраная спасылка) | У тым ліку наперад і назад два |
| Праймеры (ген-мішэнь) | У тым ліку наперад і назад два |
| Мэтавая Si РНК (3 палоскі) | Як правіла, кампанія сінтэзуе 3 палоскі, а затым выбірае адну з трох з дапамогай RT-PCR |
| Набор трансфекцыі | Lipo2000 і г.д. |
| Набор для хуткай экстракцыі РНК | Для экстракцыі РНК пасля трансфекцыі |
| Набор для хуткай зваротнай транскрыпцыі | для сінтэзу кДНК |
| Набор для ПЦР-ампліфікацыі | 2×Super SYBR Green Майстар-мікс qPCR |
2.4 Што тычыцца пытанняў, на якія неабходна звярнуць увагу на канкрэтных эксперыментальных этапах:
①працэс трансфекцыі siRNA
1. Для пасева вы можаце выбраць 24-лункавы, 12-лункавы або 6-лункавы пласціны (сярэдняя канцэнтрацыя РНК, прапанаваная ў кожнай лунцы 24-лункавага планшэта, складае каля 100-300 нг/мкл), а аптымальная шчыльнасць трансфекцыі клетак складае да 60%-80% або каля таго.
2. Этапы трансфекцыі і асаблівыя патрабаванні строга адпавядаюць інструкцыям.
3. Пасля трансфекцыі ўзоры можна сабраць на працягу 24-72 гадзін для выяўлення мРНК (RT-PCR) або выяўлення бялку на працягу 48-96 гадзін (WB)
② працэс экстракцыі РНК
1. Прадухіленне заражэння экзагеннымі ферментамі.У асноўным гэта ўключае ў сябе строгае нашэнне масак і пальчатак;выкарыстанне стэрылізаваных наканечнікаў піпетак і прабірак EP;вада, якая выкарыстоўваецца ў эксперыменце, не павінна ўтрымліваць РНКазы.
2. Рэкамендуецца зрабіць двойчы, як гэта прапануецца ў наборы для хуткай экстракцыі, што сапраўды палепшыць чысціню і ўраджайнасць.
3. Адпрацаваная вадкасць не павінна дакранацца слупка РНК.
③ Колькаснае вызначэнне РНК
Пасля экстракцыі РНК яе можна вызначыць колькасна непасрэдна з дапамогай Nanodrop, а мінімальнае паказанне можа складаць усяго 10 нг/мкл.
④Працэс зваротнай транскрыпцыі
1. З-за высокай адчувальнасці RT-qPCR неабходна зрабіць як мінімум 3 паралельныя лункі для кожнага ўзору, каб наступнае Ct не было занадта розным або SD не было занадта вялікім для статыстычнага аналізу.
2. Не замарожвайце і не размарожвайце Master mix паўторна.
3. Кожную трубку/адтуліну неабходна замяніць новым наканечнікам!Не выкарыстоўвайце пастаянна адзін і той жа наканечнік піпеткі для дадання ўзораў!
4. Плёнку, прымацаваную да 96-лункавага пласціны пасля дадання ўзору, трэба разгладзіць пласцінай.Лепш за ўсё адцэнтрыфугаваць, перш чым пакласці яго ў машыну, каб вадкасць са сценкі трубкі магла сцякаць і выдаляць бурбалкі паветра.
⑤Аналіз агульнай крывой
| Няма перыяду лагарыфмічнага росту | Магчымая высокая канцэнтрацыя шаблону |
| Няма значэння КТ | Няправільныя крокі для выяўлення флуарэсцэнтных сігналаў; дэградацыя праймеров або зондаў - яе цэласнасць можна выявіць з дапамогай PAGE электрафарэзу; недастатковая колькасць шаблону; дэградацыя шаблонаў - пазбяганне ўвядзення прымешак і паўторнага замарожвання і адтавання пры падрыхтоўцы проб; |
| Ct>38 | Нізкая эфектыўнасць ўзмацнення;прадукт ПЦР занадта доўгі;розныя кампаненты рэакцыі дэградуюць |
| Лінейная крывая ўзмацнення | Зонды могуць часткова сапсавацца ў выніку паўторных цыклаў замарожвання-адтавання або працяглага ўздзеяння святла |
| Розніца ў дубляваных адтулінах асабліва вялікая | Рэакцыйны раствор не цалкам расплавіўся або рэакцыйны раствор не змешаны;тэрмальная ванна ПЦР-інструмента забруджаная флуоресцентными рэчывамі |
2.5 Аб аналізе дадзеных
Аналіз даных КПЦР можна падзяліць на адноснае колькаснае і абсалютнае колькаснае вызначэнне.Напрыклад, клеткі ў апрацаванай групе ў параўнанні з клеткамі ў кантрольнай групе,
Колькі разоў змяняецца мРНК гена X, гэта адносная колькасная ацэнка;у пэўнай колькасці клетак — іРНК гена Х
Колькі там асобнікаў, гэта абсалютная колькасць.Звычайна ў лабараторыі мы часцей за ўсё выкарыстоўваем адносны колькасны метад.звычайна,метад 2-ΔΔctчасцей за ўсё выкарыстоўваецца ў эксперыментах, таму тут будзе падрабязна прадстаўлены толькі гэты метад.
Метад 2-ΔΔct: Атрыманы вынік - гэта розніца ў экспрэсіі мэтавага гена ў эксперыментальнай групе адносна мэтавага гена ў кантрольнай групе.Патрабуецца, каб эфектыўнасць ампліфікацыі як мэтавага гена, так і ўнутранага эталоннага гена была блізкая да 100%, а адноснае адхіленне не павінна перавышаць 5%.
Метад разліку наступны:
Δct кантрольная група = значэнне ct мэтавага гена ў кантрольнай групе - значэнне ct ўнутранага эталоннага гена ў кантрольнай групе
Δct эксперыментальная група = ct значэнне мэтавага гена ў эксперыментальнай групе - ct значэнне ўнутранага эталоннага гена ў эксперыментальнай групе
ΔΔct=Δct эксперыментальная група-Δct кантрольная група
Нарэшце, вылічыце кратнае розніцы ва ўзроўні выразнасці:
Change Fold=2-ΔΔct (функцыя excel адпавядае POWER)
Спадарожныя тавары:
Час публікацыі: 20 мая 2023 г
