一、Павышэнне адчувальнасці рэакцыйнай сістэмы:

1. Вылучыце высакаякасную РНК:

Паспяховы сінтэз кДНК адбываецца з высакаякаснай РНК.Высакаякасная РНК павінна быць як мінімум поўнай даўжыні і не ўтрымліваць інгібітараў зваротнай транскрыптазы, такіх як EDTA або SDS.Якасць РНК вызначае максімальную колькасць інфармацыі аб паслядоўнасці, якую вы можаце транскрыбаваць у кДНК.Распаўсюджаным метадам ачысткі РНК з'яўляецца аднаэтапны метад з выкарыстаннем гуанідзінізатыяцыяната/кіслага фенолу.Каб прадухіліць заражэнне следавымі колькасцямі РНКазы, РНК, вылучаную з узбагачаных РНКазамі узораў (напрыклад, з падстраўнікавай залозы), неабходна захоўваць у фармальдэгіде, каб захаваць высакаякасную РНК, асабліва пры працяглым захоўванні.РНК, вынятая з печані пацукі, у асноўным дэградавала пасля захоўвання ў вадзе на працягу аднаго тыдня, у той час як РНК, вынятая з селязёнкі пацукі, заставалася стабільнай пасля захоўвання ў вадзе на працягу 3 гадоў.Акрамя таго, стэнаграмы даўжынёй больш за 4 кб больш адчувальныя да дэградацыі следавымі РНКазамі, чым невялікія стэнаграмы.Каб павялічыць стабільнасць захаваных узораў РНК, РНК можна растварыць у дэіянізаваным фармамідзе і захоўваць пры -70°C.Формамід, які выкарыстоўваецца для захавання РНК, не павінен утрымліваць рэшткаў, якія разбураюць РНК.РНК падстраўнікавай залозы можа захоўвацца ў фармамідзе не менш за год.Пры падрыхтоўцы да выкарыстання РНК вы можаце выкарыстоўваць наступны метад для асаджэння РНК: дадайце NaCl да 0,2 М і 4-кратны аб'ём этанолу, пастаўце пры пакаёвай тэмпературы на 3-5 хвілін і цэнтрыфугуйце пры 10 000×g на працягу 5 хвілін.

2. Выкарыстоўвайце зваротную транскрыптазу, неактыўную РНКазу (РНКазу Н):

Інгібітары РНКазы часта дадаюць у рэакцыі зваротнай транскрыпцыі, каб павялічыць даўжыню і выхад сінтэзу кДНК.Інгібітары РНКазы варта дадаваць падчас рэакцыі сінтэзу першай ланцуга ў прысутнасці буфера і аднаўляльніка (напрыклад, ДТТ), паколькі працэс, які папярэднічае сінтэзу кДНК, дэнатуруе інгібітар, вызваляючы тым самым звязаную РНКазу, якая можа разбураць РНК.Бялковыя інгібітары РНКазы прадухіляюць толькі дэградацыю РНКазы РНКазамі A, B, C і не перашкаджаюць пападанню РНКазы на скуру, таму будзьце асцярожныя, каб не ўводзіць РНКазу пальцамі, нягледзячы на ​​выкарыстанне гэтых інгібітараў.

Зваротная транскрыптаза каталізуе ператварэнне РНК у кДНК.І M-MLV, і AMV валодаюць эндагеннай актыўнасцю РНКазы H у дадатак да ўласнай актыўнасці палімеразы.Актыўнасць РНКазы H і актыўнасць палімеразы канкуруюць адна з адной за гібрыдны ланцуг, які ўтвараецца паміж матрыцай РНК і праймерам ДНК або ланцугом падаўжэння кДНК, і дэградуюць ланцуг РНК у комплексе РНК:ДНК.Матрыца РНК, дэградаваная актыўнасцю РНКазы, больш не можа служыць эфектыўным субстратам для сінтэзу кДНК, што зніжае выхад і працягласць сінтэзу кДНК.Такім чынам, было б карысна ліквідаваць або значна знізіць актыўнасць РНКазы H зваротнай транскрыптазы.。

Зваротная транскрыптаза SuperScript Ⅱ, зваротная транскрыптаза RNaseH-MMLV і зваротная транскрыптаза thermoScript, RNaseH-AMV, могуць атрымаць большую колькасць і больш поўнаметражнай кДНК, чым MMLV і AMV.На адчувальнасць RT-PCR будзе ўплываць колькасць сінтэзу кДНК.ThermoScript значна больш адчувальны, чым AMV.Памер прадуктаў RT-PCR абмежаваны здольнасцю зваротнай транскрыптазы сінтэзаваць кДНК, асабліва пры кланаванні вялікіх кДНК.У параўнанні з MMLV, SuperScripⅡ значна павялічыў выхад доўгіх прадуктаў RT-PCR.РНКазаН-зваротная транскриптаза таксама валодае падвышанай термостабильностью, таму рэакцыю можна праводзіць пры тэмпературах вышэй нармальных 37-42 ° С.У прапанаваных умовах сінтэзу выкарыстоўвайце аліга(dT) праймер і 10 мкКі [α-P]dCTP.Агульны выхад першай ніткі быў разлічаны з выкарыстаннем метаду асаджэння TCA.Поўную даўжыню кДНК аналізавалі з дапамогай адсартаваных па памерах палос, выразаных і падлічаных на шчолачным агарозным гелі.

3. Павялічце тэмпературу інкубацыі для зваротнай транскрыпцыі:

Больш высокая тэмпература інкубацыі дапамагае адкрыць другасную структуру РНК, павялічваючы выхад рэакцыі.Для большасці шаблонаў РНК інкубацыя РНК і праймераў пры 65°C без буфера або солі з наступным хуткім астуджэннем на лёдзе ліквідуе большасць другасных структур і дазволіць праймерам звязвацца.Аднак некаторыя шаблоны ўсё яшчэ маюць другасныя структуры, нават пасля цеплавой дэнатурацыі.Ампліфікацыю гэтых складаных шаблонаў можна выканаць з дапамогай зваротнай транскрыптазы ThermoScript і размяшчэння рэакцыі зваротнай транскрыпцыі пры больш высокай тэмпературы для паляпшэння ампліфікацыі.Больш высокія тэмпературы інкубацыі таксама могуць павялічыць спецыфічнасць, асабліва калі для сінтэзу кДНК выкарыстоўваюцца генаспецыфічныя праймеры (ГСП) (гл. Главу 3).Пры выкарыстанні GSP пераканайцеся, што Tm праймераў супадае з чаканай тэмпературай інкубацыі.Не выкарыстоўвайце аліга(dT) і выпадковыя праймеры пры тэмпературы вышэй за 60°C.Выпадковыя праймеры патрабуюць інкубацыі пры 25°C на працягу 10 хвілін перад павышэннем да 60°C.У дадатак да выкарыстання больш высокай тэмпературы зваротнай транскрыпцыі, спецыфічнасць таксама можа быць палепшана шляхам непасрэднага пераносу сумесі РНК/праймера з тэмпературы дэнатурацыі 65°C на тэмпературу інкубацыі зваротнай транскрыпцыі і дадання папярэдне разагрэтай рэакцыйнай сумесі 2× (сінтэз кДНК з гарачым стартам).Такі падыход дапамагае прадухіліць міжмалекулярнае спарванне асноў, якое адбываецца пры больш нізкіх тэмпературах.Шматразовае пераключэнне тэмпературы, неабходнае для RT-PCR, можна спрасціць з дапамогай термоциклера.

Tth тэрмастабільная палімераза дзейнічае як ДНК-полимераза ў прысутнасці Mg2+ і як РНК-полимераза ў прысутнасці Mn2+.Яго можна захоўваць у цяпле пры максімальнай тэмпературы 65°C.Аднак прысутнасць Mn2+ падчас ПЦР зніжае дакладнасць, што робіць Tth-палімеразу менш прыдатнай для высокадакладнай ампліфікацыі, такой як кланаванне кДНК.Акрамя таго, Tth мае нізкую эфектыўнасць зваротнай транскрыпцыі, што зніжае адчувальнасць, і, паколькі зваротная транскрыпцыя і ПЦР могуць быць выкананы з дапамогай аднаго фермента, кантрольныя рэакцыі без зваротнай транскрыпцыі не могуць быць выкарыстаны для параўнання прадуктаў ампліфікацыі кДНК з забруджвальнай геномнай ДНК.Прадукты ампліфікацыі падзялялі.

4. Дабаўкі, якія спрыяюць зваротнай транскрыпцыі:

Дабаўкі, уключаючы гліцэрына і ДМСО, дадаюцца ў рэакцыю сінтэзу першага ланцуга, што можа знізіць стабільнасць двухланцуговай нуклеінавай кіслаты і развязаць другасную структуру РНК.Можна дадаваць да 20% гліцэрыны або 10% ДМСО без уплыву на актыўнасць SuperScript II або MMLV.AMV таксама можа пераносіць да 20% гліцэрыны без страты актыўнасці.Каб максымізаваць адчувальнасць RT-PCR у рэакцыі зваротнай транскрыпцыі SuperScriptⅡ, можна дадаць 10% гліцэрыны і інкубаваць пры 45°C.Калі да ПЦР дадаць 1/10 прадукту рэакцыі зваротнай транскрыпцыі, то канцэнтрацыя гліцэрыны ў рэакцыі ампліфікацыі складзе 0,4%, чаго недастаткова для інгібіравання ПЦР.

5. Лячэнне РНКазы:

Апрацоўка рэакцый сінтэзу кДНК РНКазой перад ПЦР можа павялічыць адчувальнасць.Лічыцца, што для некаторых шаблонаў РНК у рэакцыі сінтэзу кДНК прадухіляе звязванне прадуктаў ампліфікацыі, і ў гэтым выпадку апрацоўка РНКазай можа павялічыць адчувальнасць.Як правіла, лячэнне РНКазы H неабходна пры ампліфікацыі больш доўгіх поўнаметражных шаблонаў кДНК-мішэняў, такіх як малакопійны туберозны шэроз II.Для гэтага складанага шаблону апрацоўка РНКазой узмацніла сігнал, выраблены SuperScript II або сінтэзаванай AMV кДНК.Для большасці рэакцый RT-PCR апрацоўка РНКазой H неабавязковая, таму што этап дэнатурацыі ПЦР пры 95°C звычайна гідралізуе РНК у комплексе РНК:ДНК.

6. Удасканаленне метаду выяўлення малой РНК:

RT-PCR асабліва складаная, калі даступныя толькі невялікія колькасці РНК.Глікаген, дададзены ў якасці носьбіта падчас выдзялення РНК, дапамагае павялічыць выхад невялікіх узораў.Глікаген без РНКаз можа быць дададзены адначасова з даданнем Тризола.Глікаген раствараецца ў вадзе і можа захоўвацца ў воднай фазе разам з РНК, каб спрыяць наступнаму ападку.Для узораў менш за 50 мг тканіны або 106 культывуемых клетак рэкамендуемая канцэнтрацыя глікагену без РНКазы складае 250 мкг/мл.

Даданне ацэтыляванага BSA да рэакцыі зваротнай транскрыпцыі з выкарыстаннем SuperScript II можа павялічыць адчувальнасць, а для невялікіх колькасцяў РНК памяншэнне колькасці SuperScript II і даданне 40 адзінак інгібітара нуклеазы RNaseOut можа павялічыць узровень выяўлення.Калі ў працэсе вылучэння РНК выкарыстоўваецца глікаген, пры выкарыстанні SuperScript II для рэакцыі зваротнай транскрыпцыі па-ранейшаму рэкамендуецца дадаваць BSA або інгібітар РНКазы.

二、Павышэнне спецыфічнасці RT-PCR

1. Асінтэз CND:

Сінтэз кДНК першага ланцуга можа быць ініцыяваны трыма рознымі метадамі, адносная спецыфічнасць якіх уплывае на колькасць і тып сінтэзаванай кДНК.

Метад выпадковага праймера быў найменш спецыфічным з трох метадаў.Праймеры адпальваюцца ў некалькіх месцах па ўсёй стэнаграме, утвараючы кароткія кДНК няпоўнай даўжыні.Гэты метад часта выкарыстоўваецца для атрымання 5'-канчатковых паслядоўнасцей і для атрымання кДНК з матрыц РНК з абласцямі другаснай структуры або з сайтамі тэрмінацыі, якія не могуць быць рэплікаваны зваротнай транскрыптазай.Каб атрымаць самую доўгую кДНК, суадносіны праймераў і РНК у кожным узоры РНК неабходна вызначыць эмпірычнаму.Пачатковая канцэнтрацыя выпадковых праймераў вагалася ад 50 да 250 нг на 20 мкл рэакцыі.Паколькі кДНК, сінтэзаваная з сумарнай РНК з выкарыстаннем выпадковых праймераў, у асноўным з'яўляецца рыбасомальнай РНК, у якасці шаблону звычайна выбіраюць полі(А)+РНК.

Праймеры Oligo(dT) больш спецыфічныя, чым выпадковыя праймеры.Ён гібрыдызуецца з полі(А) хвастом, які знаходзіцца на 3'-канцы большасці эукарыятычных мРНК.Паколькі полі(А)+ РНК складае прыблізна ад 1% да 2% ад агульнай колькасці РНК, колькасць і складанасць кДНК значна менш, чым са выпадковымі праймерамі.З-за сваёй высокай спецыфічнасці аліга(dT) звычайна не патрабуе аптымізацыі суадносін РНК і праймераў і выбару полі(А)+.Рэкамендуецца выкарыстоўваць 0,5 мкг аліга(dT) на 20 мкл рэакцыйнай сістэмы.oligo(dT)12-18 падыходзіць для большасці RT-PCR.Сістэма ThermoScript RT-PCR прапануе oligo(dT)20 дзякуючы лепшай тэрмічнай стабільнасці для больш высокіх тэмператур інкубацыі.

Генеспецыфічныя праймеры (GSP) з'яўляюцца найбольш спецыфічнымі праймерамі для этапу зваротнай транскрыпцыі.GSP - гэта антысэнсавы алігануклеатыд, які можа спецыфічна гібрыдызавацца з паслядоўнасцю-мішэнню РНК, у адрозненне ад выпадковых праймераў або аліга(dT), якія адпальваюцца з усімі РНК.Тыя ж правілы, якія выкарыстоўваюцца для распрацоўкі праймераў для ПЦР, прымяняюцца да распрацоўкі GSP у рэакцыях зваротнай транскрыпцыі.GSP можа быць той жа паслядоўнасцю, што і праймер ампліфікацыі, які адпальваецца да самага 3'-канца мРНК, або GSP можа быць распрацаваны для адпалу пасля праймера зваротнай ампліфікацыі.Для некаторых ампліфікаваных суб'ектаў для паспяховай RT-PCR неабходна распрацаваць некалькі антысэнсавых праймераў, таму што другасная структура РНК-мішэні можа перашкаджаць звязванню праймераў.Рэкамендуецца выкарыстоўваць 1 пмоль антысэнс GSP у 20 мкл рэакцыі сінтэзу першай ніткі.

2. Павялічце тэмпературу інкубацыі для зваротнай транскрыпцыі:

Каб у поўнай меры выкарыстаць усе перавагі спецыфічнасці GSP, варта выкарыстоўваць зваротную транскрыптазу з больш высокай тэрмастабільнасцю.Тэрмастабільныя зваротныя транскрыптазы можна інкубаваць пры больш высокіх тэмпературах, каб павялічыць жорсткасць рэакцыі.Напрыклад, калі GSP адпальваецца пры 55°C, спецыфічнасць GSP не будзе цалкам выкарыстана, калі AMV або M-MLV выкарыстоўваюцца для зваротнай транскрыпцыі пры нізкай жорсткасці 37°C.Тым не менш, SuperScript II і ThermoScript могуць уступаць у рэакцыю пры 50°C або вышэй, што ліквідуе неспецыфічныя прадукты, якія ўтвараюцца пры больш нізкіх тэмпературах.Для максімальнай спецыфічнасці сумесь РНК/праймер можа быць перанесена непасрэдна з тэмпературы дэнатурацыі 65°C на тэмпературу інкубацыі зваротнай транскрыпцыі і дададзена ў папярэдне разагрэтую рэакцыйную сумесь 2× (гарачы старт сінтэзу кДНК).Гэта дапамагае прадухіліць міжмалекулярнае спарванне асноў пры нізкіх тэмпературах.Некалькі тэмпературных пераходаў, неабходных для RT-PCR, можна спрасціць з дапамогай термоциклера.

3. Памяншае забруджванне геномнай ДНК:

Патэнцыйная цяжкасць, якая ўзнікае пры RT-PCR, - гэта забруджванне геномнай ДНК у РНК.Выкарыстанне добрага метаду выдзялення РНК, такога як рэагент Трызол, паменшыць колькасць геномнай ДНК, якая забруджвае прэпарат РНК.Каб пазбегнуць прадуктаў, атрыманых з геномнай ДНК, РНК можна апрацаваць ДНКазай I ступені ампліфікацыі, каб выдаліць забруджвальную ДНК перад зваротнай транскрыпцыяй.Расшчапленне ДНКазой I было спынена шляхам інкубацыі ўзораў у 2,0 мМ ЭДТА на працягу 10 хвілін пры 65°C.ЭДТА можа хелатировать іёны магнію, прадухіляючы залежны ад іёнаў магнію гідроліз РНК пры высокіх тэмпературах.

Для таго, каб аддзяліць ампліфікаваную кДНК ад забруджвальных прадуктаў ампліфікацыі геномнай ДНК, можна распрацаваць праймеры, якія адпальваюць кожны экзон.ПЦР-прадукты, атрыманыя з кДНК, будуць карацейшымі, чым прадукты, атрыманыя з забруджанай геномнай ДНК.Акрамя таго, кантрольны эксперымент без зваротнай транскрыпцыі быў праведзены на кожнай матрыцы РНК, каб вызначыць, ці быў дадзены фрагмент атрыманы з геномнай ДНК або кДНК.Прадукт ПЦР, атрыманы без зваротнай транскрыпцыі, атрымліваецца з геному.