Традыцыйныя зваротныя транскриптазы не вытрымліваюць высокіх тэмператур (аптымальная тэмпература для актыўнасці MMLV складае 37-50 ° C, а AMV - 42-60 ° C).Больш складаная вірусная РНК не можа быць эфектыўна адваротна транскрыбавана ў кДНК пры нізкіх тэмпературах, што прыводзіць да зніжэння эфектыўнасці выяўлення.Традыцыйная RT-qPCR звычайна патрабуе ўдзелу двух ключавых ферментаў (зваротнай транскриптазы і ДНК-полимеразы), што не дазваляе спрасціць працу рэакцыйнай сістэмы і знізіць кошт.Тут мы прадставім дзве ўстойлівыя да высокіх тэмператур зваротныя транскрыптазы, TtH і RevTaq.Гэтыя два ферменты таксама выконваюць функцыю ДНК-палімеразы, таму іх называюць біфункцыянальнымі ферментамі.

TtH ДНК-палімераза

Вы напэўна чулі пра TtH, які атрымліваецца з цеплалюбівай бактэрыі Thermus thermophilus HB8.У прысутнасці двухвалентных катыёнаў, такіх як Mg2+, ён валодае ДНК-палімеразнай актыўнасцю.Ён шырока выкарыстоўваецца ў рэакцыях ПЦР, як фермент Taq, але мае больш высокую тэрмаўстойлівасць, чым фермент Taq, таму ён таксама аказвае лепшы эфект на ПЦР з шаблонамі з высокім утрыманнем GC.

· Гэты фермент у асноўным не мае 3'→5' экзануклеазнай актыўнасці і 5'→3' экзануклеазнай актыўнасці, таму яго таксама можна выкарыстоўваць для дидезоксисеквенирования.

· Гэты фермент валодае актыўнасцю RTase.У прысутнасці Mn2+ актыўнасць RTase будзе ўзмацняцца.З дапамогай гэтай функцыі яго можна выкарыстоўваць для правядзення рэакцыі зваротнай транскрыпцыі і рэакцыі ПЦР у адной прабірцы, гэта значыць аднаэтапнай RT-PCR.Аднак у прысутнасці Mn2+ дакладнасць RT-PCR не высокая.Актыўнасць RT не мае нічога агульнага з актыўнасцю РНКазы Н.

· Падвышаная актыўнасць Tth-ДНК-палімеразы (pH9, аптымальнае +55℃～+70℃, максімальнае +95℃) пераадольвае праблемы, выкліканыя другаснай структурай РНК.Атрыманую кДНК можна амплифицировать з дапамогай ПЦР з тым жа ферментам у прысутнасці іёнаў Mg2+.

· Здольнасць Tth-ДНК-палімеразы выконваць зваротную транскрыпцыю і ампліфікацыю ДНК пры высокіх тэмпературах робіць гэты фермент карысным для колькаснай RT-PCR, кланавання і аналізу экспрэсіі генаў клеткавай і віруснай РНК.
· Tth-ДНК-полимераза выкарыстоўваецца для RT-PCR для ампліфікацыі РНК да 1kb.

Асаблівасці і перавагі

Tth ДНК-палімераза:

• Забяспечце аптымізаваны памер прадукту палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЦР), па меншай меры, 1000 bp у рэакцыі RT-PCR

• Прымайце ў якасці субстрата мадыфікаваны дезоксирибонуклеозидтрифосфат

• Не звязаны з актыўнасцю РНКазы H

• Валодае высокай тэрмічнай стабільнасцю для пераадолення праблем, звычайна звязаных з высокай другаснай структурай, прысутнай у РНК

RevTaq RT-PCR ДНК-палімераза

Тэрмаўстойлівая ДНК-полимераза з актыўнасцю зваротнай транскриптазы

RevTaq-RT-PCR-ДНК-палімераза - гэта сканструяваны, вельмі тэрмаўстойлівы, двухфункцыянальны фермент з актыўнасцю зваротнай транскрыптазы і ДНК-палімеразы, атрыманы шляхам накіраванай і штучнай эвалюцыі.

· Перыяд паўраспаду RevTaq RT-PCR ДНК-палімеразы пры 95°C больш за 40 хвілін.

· ДНК-палімераза RevTaq RT-PCR дазваляе ажыццяўляць зваротную транскрыпцыю пры высокай тэмпературы непасрэдна з шаблону РНК, і этап зваротнай транскрыпцыі можна паўтарыць некалькі разоў, каб стварыць больш шаблонаў кДНК.

· ДНК-полімераза Revtaq ​​RT-PCR дазваляе "нулявы крок" RT-PCR (адсутнічае крок зваротнай транскрыпцыі ізатэрмічнай зваротнай транскрыпцыі), таму што ў этапе пашырэння цыклічнага ПЦР зваротная транскрыпцыя і ўзмацненне ДНК адбываюцца адначасова.Гэта таксама спрыяе рэакцыі зваротнай транскрыпцыі пры высокіх тэмпературах, тым самым зводзячы да мінімуму праблемы, якія ўзнікаюць пры расплаўленні моцнай другаснай структуры РНК пры высокіх тэмпературах.

· Дзякуючы формуле гарачага старту на аснове аптамераў ДНК-палімераза RevTaq RT-PCR дасць лепшыя вынікі, калі тэмпература адпалу і падаўжэння вышэй за 57°C.

· Паколькі фермент тэрмаўстойлівы, рэкамендуецца распрацоўваць праймеры і зонды з вельмі высокай тэмпературай плаўлення (>60°C).

· Рэкамендуецца аптымізаваць тэмпературу этапу адпалу/пашырэння праз тэмпературны градыент падчас працэсу наладкі рэакцыі.

· Чым вышэй тэмпература, тым вышэй спецыфічнасць ПЦР.Цыкл зваротнай транскрыпцыі звычайна выконваецца пры больш высокай тэмпературы, чым цыкл ПЦР, таму што гібрыдызацыя ДНК-праймер: шаблон РНК звычайна мае больш высокую тэмпературу плаўлення, чым дуплекс ДНК-праймер: шаблон кДНК.

· ДНК-палімераза RevTaq RT-PCR створана геннай інжынерыяй і аптымізавана, а памер амплікона складае 60-300 п.н.

Ліміт выяўлення ДНК-палімеразы RevTaq RT-PCR дасягае 4 копій/

Аптымізаваная сістэма рэакцыі (усталяванне праймераў з высокай тэмпературай плаўлення) паказана на малюнку.RevTaq RT-PCR з ДНК-палімеразай RT-PCR паказвае лепшую адчувальнасць, чым TaqPath 1-этапная RT-qPCR майстар-мікс, і больш нізкі градыент выяўлення развядзення ўзору.

Больш пераваг:

Функцыя хуткага запуску → Пачатковы этап цеплавой дэнатурацыі можна прапусціць.

Формула аптамера гарачага старту → Неадкладна забяспечвае 100% актыўнасць фермента і прадухіляе неспецыфічнае ўзмацненне пры нізкіх тэмпературах (<57°C).

Функцыя расшчаплення → Этап экстракцыі РНК апушчаны, таму што ДНК-палімераза RevTaq RT-PCR можа таксама апрацоўваць сырыя ўзоры рэакцыі.Ён можа неадкладна разбурыць клеткавыя мембраны эўкарыёт, бактэрый і вірусаў у гарачым цыкле RT-PCR.

IVD ўзровень сыравіны → высокія стандарты якасці і надзвычай канкурэнтаздольныя цэны