Як новы ў лабараторыі, гэта не вельмі добрая праца, каб адсеяць станоўчыя расліны з групы раслін з нізкім каэфіцыентам канверсіі.Спачатку трэба вылучыць ДНК з вялікай колькасці ўзораў адзін за адным, а затым чужародныя гены выяўляюць метадам ПЦР.Тым не менш, вынікі часта бываюць пустымі і час ад часу палосамі з некалькімі элементамі, але немагчыма вызначыць, ці ёсць прапушчаныя або ілжывыя выяўлення..Ці вельмі бездапаможна сутыкнуцца з такім эксперыментальным працэсам і вынікамі?Не хвалюйцеся, брат навучыць вас, як лёгка і дакладна адсеяць трансгенныя станоўчыя расліны.

Крок 1

Праймеры для выяўлення дызайну

Вызначце эндагенны ген і экзагенны ген, якія трэба выявіць, у адпаведнасці з узорам, які падлягае тэсціраванню, і абярыце рэпрэзентатыўную паслядоўнасць 100-500 п.н. у гене для распрацоўкі праймера.Добрыя праймеры могуць забяспечыць дакладнасць вынікаў выяўлення і скараціць час выяўлення (гл. дадатак для праймераў выяўлення, якія звычайна выкарыстоўваюцца).

Заўвага: нядаўна распрацаваныя праймеры павінны аптымізаваць умовы рэакцыі і праверыць дакладнасць, дакладнасць і мяжу выяўлення перад буйнамаштабным выяўленнем.

Крок 2

Распрацуйце пратакол эксперыменту

Станоўчы кантроль: выкарыстоўвайце вычышчаную ДНК, якая змяшчае мэтавы фрагмент, у якасці шаблону, каб вызначыць, ці нармальныя сістэма і ўмовы рэакцыі ПЦР.

Адмоўны/пусты кантроль: выкарыстоўвайце шаблон ДНК або ddH2O, які не змяшчае мэтавага фрагмента, у якасці шаблону, каб вызначыць, ці ёсць крыніца заражэння ў сістэме ПЦР.

Унутраны эталонны кантроль: выкарыстоўвайце камбінацыю праймера/зонда эндагеннага гена ўзору, які падлягае тэсціраванню, каб ацаніць, ці можна выявіць шаблон метадам ПЦР.

Заўвага:

Станоўчы, адмоўны/пусты кантроль і ўнутраны кантроль павінны быць устаноўлены для кожнага тэсту, каб ацаніць сапраўднасць вынікаў эксперыменту.

Падрыхтоўка доследу

Перад выкарыстаннем прасачыце, ці раўнамерна змяшаны раствор.Пры выпадзенні асадка перад ужываннем яго неабходна растварыць і змяшаць у адпаведнасці з інструкцыяй.Сумесь 2 × ПЦР неабходна некалькі разоў змяшаць з дапамогай мікрапіпеткі перад выкарыстаннем, каб пазбегнуць нераўнамернага размеркавання іёнаў.

Заўвага:

Дастаньце інструкцыю і ўважліва прачытайце яе, а таксама падрыхтуйцеся перад эксперыментам у строгай адпаведнасці з патрабаваннямі інструкцыі.

Крок 4

Падрыхтуйце рэакцыйную сістэму ПЦР

У адпаведнасці з пратаколам эксперыменту змяшайце праймеры, H2O і 2×PCR, адцэнтрыфугуйце і размеркуйце іх у кожную рэакцыйную прабірку.

Заўвага:

Для буйнамаштабнага або доўгатэрміновага тэсціравання рэкамендуецца выкарыстоўваць рэакцыйную сістэму ПЦР, якая змяшчае фермент UNG, які можа эфектыўна пазбегнуць аэразольнага забруджвання, выкліканага прадуктамі ПЦР.

Крок 5

Дадаць шаблон рэакцыі

Выкарыстоўваючы тэхналогію Direct PCR, няма неабходнасці ў стомным працэсе ачысткі нуклеінавых кіслот, шаблон узору можна падрыхтаваць на працягу 10 хвілін і дадаць адпаведную рэакцыйную сістэму ПЦР.

Заўвага:

Метад расшчаплення мае лепшы эфект выяўлення, і атрыманы прадукт можна выкарыстоўваць для некалькіх рэакцый выяўлення.

5.1: Прамое распусканне лісця

У адпаведнасці з памерам малюнка ў кіраўніцтве адрэжце тканіну ліста дыяметрам 2-3 мм і змесціце яе ў рэакцыйную сістэму ПЦР.

Заўвага: пераканайцеся, што фрагменты лісця цалкам пагружаны ў рэакцыйны раствор для ПЦР, і не дадавайце лішак тканіны лісця.

5.2: Метад расшчаплення лісця

Адрэжце тканіна ліста дыяметрам 5-7 мм і змесціце яе ў центрифужную прабірку.Калі вы выбіраеце спелыя лісце, пазбягайце выкарыстання тканін галоўнай жылкі ліста.Закапайце 50 мкл лізата буфера P1 у цэнтрыфужную прабірку, каб пераканацца, што лізат можа цалкам пагрузіць тканіну ліста, змесціце яго ў тэрмацыклер або металічную ванну і лізуйце пры 95°C на працягу 5-10 хвілін.

Дадайце 50 мкл нейтралізацыйнага раствора буфера P2 і добра змяшайце.Атрыманы лізат можа быць выкарыстаны ў якасці шаблону і дададзены ў рэакцыйную сістэму ПЦР.

Заўвага: колькасць шаблону складае 5-10% ад ПЦР-сістэмы і не павінна перавышаць 20% (напрыклад, у 20-мкл ПЦР-сістэму дадайце 1-2 мкл раствора для лізісу, не больш за 4 мкл).

Крок 6

ПЦР-рэакцыя

Пасля цэнтрыфугавання рэакцыйнай прабіркі ПЦР яе змяшчаюць у прыбор ПЦР для ампліфікацыі.

Заўвага:

У рэакцыі для ампліфікацыі выкарыстоўваецца неачышчаная матрыца, таму колькасць цыклаў ампліфікацыі на 5-10 больш цыклаў, чым пры выкарыстанні ачышчанай матрыцы ДНК.

Крок 7

Выяўленне электрафарэзу і аналіз вынікаў

M: Лесвіца ДНК памерам 100 п.о

1\4: Метад вычышчанай ДНК

2\5: Прамы метад ПЦР

3\6: пусты кантроль

КК:

Вынікі выпрабаванняў розных элементаў кіравання, устаноўленых у эксперыменце, павінны адпавядаць наступным умовам.У адваротным выпадку трэба прааналізаваць прычыну праблемы і правесці паўторны тэст пасля ліквідацыі праблемы.

Табліца 1. Нармальныя вынікі аналізаў розных кантрольных груп

*Калі плазміда выкарыстоўваецца ў якасці станоўчага кантролю, вынік тэсту на эндагенны ген можа быць адмоўным

Вынік:

А. Вынік тэсту эндагеннага гена ўзору адмоўны, што паказвае на тое, што ДНК, прыдатную для звычайнага выяўлення ПЦР, не можа быць выдзелена з узору або вынятая ДНК утрымлівае інгібітары ПЦР-рэакцыі, і ДНК трэба вылучыць яшчэ раз.

Б. Вынік тэсту эндагеннага гена ўзору з'яўляецца станоўчым, а вынік тэсту экзагеннага гена - адмоўным, што сведчыць аб тым, што ДНК, прыдатная для звычайнага ПЦР-дэтэктара, вылучана з узору, і можна меркаваць, што ген ХХХ ва ўзоры не выяўлены.

C. Вынік тэсту эндагеннага гена ўзору станоўчы, а вынік тэсту экзагеннага гена станоўчы, што паказвае на тое, што з узору была выдзелена ДНК, прыдатная для звычайнага ПЦР-дэтэктара, і ДНК ўзору змяшчае ген XXX.Пацвярджаючыя эксперыменты могуць быць праведзены далей.

Крок 8

Праймеры для выяўлення дызайну

Пасля эксперыменту выкарыстоўвайце 2% раствор гіпахларыту натрыю і 70% раствор этанолу, каб працерці эксперыментальную зону, каб прадухіліць забруджванне навакольнага асяроддзя.