• facebook
  • Linkedin
  • youtube

Некалькі рэвалюцыйных вынаходніцтваў у гісторыі тэхналогіі выяўлення, на маю думку, - гэта тэхналогія імунамаркіроўкі, заснаваная на прынцыпе спецыфічнага звязвання антыген-антыцела, тэхналогія ПЦР і тэхналогія секвенирования.Сёння мы пагаворым аб тэхналогіі ПЦР.У адпаведнасці з эвалюцыяй тэхналогіі ПЦР людзі звычайна падзяляюць тэхналогію ПЦР на тры пакаленні: тэхналогію звычайнай ПЦР, тэхналогію флуарэсцэнтнай колькаснай ПЦР у рэальным часе і тэхналогію лічбавай ПЦР.

CАгульная методыка ПЦР

w1

КАРЫ МАЛІС (1944.12.28-2019.8.7)

Кэры Муліс вынайшаў палімеразную ланцуговую рэакцыю (палімеразную ланцуговую рэакцыю, ПЦР) у 1983 годзе. Кажуць, што калі ён ехаў за рулём сваёй дзяўчыны, у яго раптам успыхнула натхненне і ён падумаў аб прынцыпе ПЦР (аб карысці кіравання аўтамабілем).Кэры Муліс атрымаў Нобелеўскую прэмію па хіміі ў 1993 г. The New York Times пракаментавала: «Вельмі арыгінальны і значны, амаль падзяляючы біялогію на перыяды да і пасля ПЦР.

Прынцып ПЦР: пры каталізе ДНК-палімеразы мацярынская ланцуг ДНК выкарыстоўваецца ў якасці матрыцы, а спецыфічны праймер выкарыстоўваецца ў якасці адпраўной кропкі падаўжэння, і даччыная ланцуг ДНК, камплементарная да мацярынскай ланцуга матрычнай ДНК, капіюецца ў у прабірцы шляхам дэнатурацыі, адпалу, пашырэння і іншых этапаў.Гэта тэхналогія ампліфікацыі сінтэзу ДНК in vitro, якая можа хутка і спецыяльна ўзмацніць любую мэтавую ДНК in vitro.

w2

Перавагі звычайнай ПЦР
1.Класічны метад, поўныя міжнародныя і айчынныя стандарты
2.Больш нізкі кошт рэагентаў для прыбораў
3.Прадукты ПЦР могуць быць адноўлены для іншых малекулярна-біялагічных эксперыментаў
Рэкамендаваны ПЦР-апарат Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Падобныя прадукты: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Недахопы звычайнай ПЦР
1.лёгка забрудзіць
2.грувасткая аперацыя
3.толькі якасны аналіз
4.Ўмераная адчувальнасць
5.Адбываецца неспецыфічнае ўзмацненне, і калі неспецыфічная паласа такога ж памеру, як мэтавая паласа, яе нельга адрозніць
 
Cапиллярный электрафарэз на аснове ПЦР
У адказ на недахопы звычайнай ПЦР некаторыя вытворцы прадставілі прыборы, заснаваныя на прынцыпе капілярнага электрафарэзу.Этап электрафарэзу пасля ПЦР-ампліфікацыі завяршаецца ў капіляры.Адчувальнасць вышэй, і розніцу ў некалькіх падставах можна адрозніць, а ўзмацненне можна разлічыць MAERKER.змест прадукту.Недахопам з'яўляецца тое, што прадукт ПЦР усё роўна трэба адкрыць і пакласці ў прыбор, і ўсё яшчэ існуе вялікая рызыка заражэння.

w3

CапіллярнаяEэлектрафарэз

 

2. Тэхналогія флуоресцентной колькаснай ПЦР у рэальным часе (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Флуарэсцэнтная колькасная ПЦР, таксама званая ПЦР у рэальным часе, - гэта новая тэхналогія колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот, распрацаваная PE (Perkin Elmer) у 1995 г. Гісторыя развіцця флуоресцентной колькаснай ПЦР - гэта гісторыя хвалюючай барацьбы такіх гігантаў, як ABI, Roche , і Bio-Rad.Калі вы зацікаўлены, вы можаце праверыць гэта.Гэтая методыка ў цяперашні час з'яўляецца самай спелай і шырока выкарыстоўванай полуколичественной методыкай ПЦР.

Рэкамендаваны апарат qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Метад флуоресцентного фарбавальніка (SYBR Green I):SYBR Green I з'яўляецца найбольш часта выкарыстоўваным ДНК-звязваючым фарбавальнікам для колькаснай ПЦР, які неспецыфічна звязваецца з двухцепочечной ДНК.У свабодным стане SYBR Green выпраменьвае слабую флуарэсцэнцыю, але пасля звязвання з двухцепочечной ДНК яе флуарэсцэнцыя павялічваецца ў 1000 разоў.Такім чынам, агульны флуарэсцэнтны сігнал, выпраменьваны рэакцыяй, прапарцыйны колькасці прысутнай двухланцуговай ДНК і будзе павялічвацца з павелічэннем узмацненага прадукту.Паколькі фарбавальнік неспецыфічна звязваецца з двухцепочечной ДНК, могуць быць атрыманы ілжывададатныя вынікі.

Звязаныя прадукты: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Метад люмінесцэнтнага зонда (тэхналогія Taqman): падчасПЦР-ампліфікацыя, спецыфічны флуарэсцэнтны зонд дадаецца адначасова з парай праймераў.Зонд уяўляе сабой лінейны алігануклеатыд з флуарэсцэнтнай рэпарцёрнай групай і флуарэсцэнтнай групай гасільніка адпаведна пазначанымі на абодвух канцах.Калі зонд цэлы, флуоресцентный сігнал, выпраменьваны рэпарцёрнай групай, паглынаецца групай тушыцеля, і выяўленне Флуарэсцэнтнага сігналу няма;падчас ПЦР-ампліфікацыі (на стадыі пашырэння) актыўнасць 5'-3' Dicer фермента Taq будзе пераварваць і дэградаваць зонд, так што рэпарцёрная флуоресцентная група і тушыцельная флуоресцентная група падзеленыя, так што сістэма маніторынгу флуарэсцэнцыі можа быць атрыманы сігнал, гэта значыць кожны раз, калі адбываецца ўзмацненне ланцуга ДНК, утвараецца флуоресцентная малекула, якая рэалізуе поўную сінхранізацыю назапашвання флуоресцентных сігналаў і адукацыі прадуктаў ПЦР.Метад зонда Taqman з'яўляецца найбольш часта выкарыстоўваным метадам выяўлення ў клінічнай дыягностыцы.

Звязаныя прадукты: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Перавагі qPCR
1.Метад спелы, а дапаможнае абсталяванне і рэагенты завершаны
2.Сярэдні кошт рэактываў
3.просты ў выкарыстанні
4.Высокая адчувальнасць і спецыфічнасць выяўлення
 
Недахопы qPCR

Мутацыя гена-мішэні прыводзіць да невыяўлення.
Немагчыма вызначыць вынік выяўлення шаблону з нізкай канцэнтрацыяй.
Пры выкарыстанні стандартнай крывой для колькаснага вызначэння існуе вялікая хібнасць.
 
3. Тэхналогія лічбавай ПЦР (digital PCR, dPCR).
Лічбавая ПЦР - гэта метад абсалютнага колькаснага вызначэння малекул нуклеінавых кіслот.У параўнанні з кПЦР лічбавая ПЦР можа непасрэдна счытваць колькасць малекул ДНК/РНК, што з'яўляецца абсалютнай колькаснай ацэнкай малекул нуклеінавых кіслот у зыходным узоры.У 1999 годзе Берт Фогельштэйн і Кенэт В. Кін-злер афіцыйна прапанавалі канцэпцыю dPCR.
 
У 2006 годзе Fluidigm быў першым, хто вырабіў камерцыйны прыбор dPCR на аснове чыпа.У 2009 годзе Life Technologies выпусціла сістэмы OpenArray і QuantStudio 12K Flex dPCR.У 2013 годзе Life Technologies запусціла сістэму QuantStudio 3DdPCR, якая выкарыстоўвае тэхналогію мікрафлюідных чыпаў высокай шчыльнасці для раўнамернага размеркавання ўзораў у 20 000 асобных клетак.у рэакцыі добра.

w5

У 2011 годзе Bio-Rad выпусціла кропельны прыбор QX100 dPCR, які выкарыстоўвае тэхналогію вады ў алеі для раўнамернага размеркавання ўзору ў 20 000 кропель вады ў алеі і выкарыстоўвае аналізатар кропель для аналізу кропель.У 2012 годзе кампанія RainDance выпусціла прыбор RainDrop dPCR, які кіруецца газам пад высокім ціскам, каб падзяліць кожную стандартную рэакцыйную сістэму на рэакцыйную эмульсію, якая змяшчае ад 1 да 10 мільёнаў мікракропель на ўзроўні пікалітраў.

w6

Да гэтага часу лічбавая ПЦР сфармавала дзве асноўныя фракцыі: чыпавую і кропельную.Незалежна ад тыпу лічбавай ПЦР, яе асноўнымі прынцыпамі з'яўляюцца абмежаванне развядзення, ПЦР канчатковай кропкі і размеркаванне Пуасона.Стандартная сістэма рэакцыі ПЦР, якая змяшчае шаблоны нуклеінавых кіслот, раўнамерна падзелена на дзясяткі тысяч рэакцый ПЦР, якія размяркоўваюцца па чыпах або мікракропельках, так што кожная рэакцыя змяшчае як мага больш малекулы шаблону, а рэакцыя ПЦР з адной малекулай шаблона выконваецца.Па счытванні флуарэсцэнцыі падлічваецца наяўнасць або адсутнасць сігналу, а абсалютная колькасная ацэнка праводзіцца пасля каліброўкі статыстычнага размеркавання Пуасона.

Ніжэй прыведзены характарыстыкі некалькіх лічбавых платформаў ПЦР, якімі я карыстаўся:

1. Кропельная лічбавая ПЦР Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 - гэта вельмі класічная лічбавая платформа ПЦР, асноўны працэс выяўлення: 20 000 узораў ствараюцца генератарам кропель. Мікракроплі вады ў алеі ўзмацняюцца на звычайнай машыне ПЦР, і, нарэшце, счытваецца сігнал флуарэсцэнцыі кожнай мікракроплі счытвальнікам мікракропель.Аперацыя больш складаная, а рызыка забруджвання сярэдні.

w7

Мікракропельная лічбавая ПЦР Xinyi TD1Xinyi TD1 - гэта айчынная лічбавая платформа ПЦР, асноўны працэс выяўлення: генерацыя 30 000-50 000 кропель вады ў алеі праз генератар кропель, узмацненне на звычайным прыборы ПЦР і, нарэшце, праход. Счытвальнік кропель счытвае флуоресцентный сігнал кожнай кроплі.І генерацыя кропель, і счытванне на гэтай платформе выконваюцца ў спецыяльным чыпе з нізкім рызыкай заражэння.

w8

 Лічбавая ПЦР з мікракропельным чыпам STILLA NaicaSTILLA Naica - адносна новая лічбавая платформа ПЦР.Асноўны працэс выяўлення: дадаць рэакцыйны раствор у чып, змясціць чып у сістэму генерацыі і ўзмацнення мікракропель і стварыць 30 000 мікракропель.Распаўсюджванне на чыпе, і ПЦР-ампліфікацыя завершана на чыпе.Затым узмоцнены чып перадаецца ў сістэму аналізу счытвання мікракропель, і флуоресцентный сігнал счытваецца шляхам фатаграфавання.Паколькі ўвесь працэс адбываецца ў закрытым чыпе, рызыка заражэння нізкі.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D чып лічбавая ПЦР

ThermoFisher QuantStudio 3D - яшчэ адна класічная лічбавая платформа ПЦР на аснове чыпа.Яго асноўны працэс выяўлення: дадайце рэакцыйны раствор у раскідчык і раўнамерна размяркуеце рэакцыйны раствор на чыпе з дапамогай 20 000 мікралунак праз раскідальнік., пастаўце чып на машыну ПЦР для ўзмацнення і, нарэшце, пастаўце чып у счытвальнік і сфатаграфуйце, каб прачытаць флуоресцентный сігнал.Аперацыя адносна складаная, і ўвесь працэс праводзіцца ў закрытым чыпе, і рызыка заражэння нізкі.

w10

5. Лічбавая ПЦР з чыпам JN MEDSYS Clarity

JN MEDSYS Clarity - адносна новая лічбавая платформа ПЦР на аснове чыпа.Яго асноўны працэс выяўлення: дадайце рэакцыйны раствор у аплікатар і раўнамерна размяркуеце рэакцыйны раствор на 10 000 прабірак для ПЦР, замацаваных у прабірцы для ПЦР, праз аплікатар.На мікрапорыстым чыпе рэакцыйны раствор трапляе ў чып праз капілярнае дзеянне, і прабірка для ПЦР з чыпам змяшчаецца ў ПЦР-машыну для ампліфікацыі, і, нарэшце, чып змяшчаецца ў счытвальнік для счытвання флуоресцентного сігналу шляхам фатаграфавання.Аперацыя больш складаная.Рызыка заражэння нізкі.

w11

Параметры кожнай лічбавай ПЦР-платформы зведзены наступным чынам:

w12

Паказчыкамі ацэнкі лічбавай ПЦР-платформы з'яўляюцца: колькасць спліт-блокаў, колькасць флуоресцентных каналаў, складанасць працы і рызыка заражэння.Але самае галоўнае - гэта дакладнасць выяўлення.Адзін са спосабаў ацэнкі лічбавых ПЦР-платформаў - выкарыстанне некалькіх лічбавых ПЦР-платформаў для праверкі адна адной, а іншы - выкарыстанне стандартных рэчываў з дакладнымі значэннямі.

Перавагі дПЦР
1.Дасягненне абсалютнай колькаснай ацэнкі
2.Больш высокая адчувальнасць і спецыфічнасць
3.Можа выяўляць нізкія ўзоры
Недахопы дПЦР1. Дарагое абсталяванне і рэагенты 2. Складаная праца і працяглы час выяўлення 3. Вузкі дыяпазон выяўлення

У цяперашні час тры пакалення тэхналогіі ПЦР маюць свае ўласныя перавагі і недахопы, і кожнае мае свае вобласці прымянення, і гэта не ўзаемасувязь таго, што адно пакаленне замяняе другое.Бесперапыннае развіццё тэхналогій надае новай жыццяздольнасці тэхналогіі ПЦР, дазваляючы ёй разблакіраваць адзін кірунак прымянення за іншым, робячы выяўленне нуклеінавых кіслот больш зручным і дакладным.
Крыніца: доктар Юань бярэ вас на абследаванне
 
Рэкамендуемыя прадукты:


Час публікацыі: 18 лістапада 2022 г