• facebook
  • Linkedin
  • youtube

ПЦР з'яўляецца найбольш шырока выкарыстоўванай тэхналогіяй ампліфікацыі нуклеінавых кіслот і шырока выкарыстоўваецца дзякуючы сваёй адчувальнасці і спецыфічнасці.Аднак ПЦР патрабуе паўторнай тэрмічнай дэнатурацыі і не можа пазбавіцца ад абмежаванняў, звязаных з прыборамі і абсталяваннем, што абмяжоўвае яе прымяненне ў клінічных палявых выпрабаваннях.

З пачатку 1990-х гадоў многія лабараторыі пачалі распрацоўваць тэхналогію ўзмацнення пастаяннай тэмпературы, якая не патрабуе тэрмічнай дэнатурацыі.Цяпер яны распрацавалі тэхналогію ізатэрмічнай ампліфікацыі, апасродкаванай пятлёй, тэхналогію ізатэрмічнай ампліфікацыі з заменай ланцуга, тэхналогію ізатэрмічнай ампліфікацыі з каціцца кругам і залежнасць паслядоўнасці нуклеінавых кіслот.Тэхналогія ізатэрмічнага ўзмацнення і іншыя тэхналогіі. 

Lапасродкаванае ізатэрмічнае ўзмацненне

Прынцып ампліфікацыі заснаваны на тым, што ДНК знаходзіцца ў стане дынамічнай раўнавагі пры тэмпературы каля 65°C.Калі любы праймер мае пару падстаў і пашыраецца да камплементарнай часткі двухланцуговай ДНК, іншая ланцуг аддзяляецца і становіцца адналанцуговай.

Пры гэтай тэмпературы ДНК выкарыстоўвае 4 спецыфічныя праймеры, якія абапіраюцца на ДНК-палімеразу са зрушэннем ланцуга, каб бесперапынна самацыркуляваць сінтэз ДНК са зрушэннем ланцуга.

Спачатку вызначыце 6 спецыфічных рэгіёнаў F3, F2, F1, B1, B2, B3 на гене-мішэні, а затым распрацуйце 4 праймера на аснове гэтых 6 спецыфічных рэгіёнаў (як паказана на малюнку ніжэй):

Пярэдні ўнутраны праймер (FIP) складаецца з F1c і F2.

Зваротны ўнутраны праймер (BIP) складаецца з B1c і B2, а TTTT выкарыстоўваецца ў якасці пракладкі ў сярэдзіне.

Знешнія праймеры F3 і B3 складаюцца адпаведна з абласцей F3 і B3 на гене-мішэні.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот

У рэакцыйнай сістэме LAMP канцэнтрацыя ўнутранага праймера ў некалькі разоў перавышае канцэнтрацыю вонкавага праймера.Унутраны праймер спачатку аб'ядноўваецца з шаблоннай ланцугом для сінтэзу камплементарнай ланцуга з адукацыяй двайнога ланцуга ДНК.Пасля знешні праймер аб'ядноўваецца з матрычным ланцугом, утвараючы двайны ланцуг ДНК.Пад дзеяннем BstДНК-полимеразы адбываецца вызваленне камплементарнай ніткі, сінтэзаванай унутраным праймером.Пасля шэрагу рэакцый камплементарная ланцуг нарэшце ўтварае адзіную ланцуг ДНК са структурай гантэлі.

Сам адзіны ланцуг ДНК са структурай гантэлі выкарыстоўваецца ў якасці шаблону для бесперапыннага фарміравання пераходнай ДНК структуры сцябло-пятля з адкрытым канцом.Унутраны і вонкавы праймеры накіроўваюць ДНК пераходнай структуры ствалавой завесы на бесперапыннае перамяшчэнне ланцугоў і рэакцыі падаўжэння і, нарэшце, утварэнне некалькіх структур ствалавой завесы рознай даўжыні.Сумесь ДНК.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот2

Перавагі і недахопы петлёвага ізатэрмічнага ўзмацнення

Перавагі LAMP:

(1) Высокая эфектыўнасць ампліфікацыі, якая можа эфектыўна ампліфікаваць 1-10 копій гена-мішэні на працягу 1 гадзіны, а эфектыўнасць ампліфікацыі ў 10-100 разоў перавышае эфектыўнасць звычайнай ПЦР.

(2) Час рэакцыі кароткі, спецыфічнасць моцная, спецыяльнае абсталяванне не патрабуецца.

Недахопы LAMP:

(1) Патрабаванні да праймераў асабліва высокія.

(2) Ампліфікаваны прадукт не можа выкарыстоўвацца для кланавання і секвеніравання, але можа быць выкарыстаны толькі для меркавання.

(3) Дзякуючы высокай адчувальнасці лёгка ўтвараць аэразолі, якія выклікаюць ілжывыя спрацоўванні і ўплываюць на вынікі тэстаў.

Sузмацненне зруху транда

Ампліфікацыя са зрушэннем ланцуга (SDA) - метад ізатэрмічнай ампліфікацыі ДНК in vitro, заснаваны на ферментатыўнай рэакцыі, упершыню прапанаваны амерыканскім навукоўцам Уокерам у 1992 годзе.

Асноўная сістэма SDA ўключае эндануклеазу рэстрыкцыі, ДНК-палімеразу з актыўнасцю замяшчэння ланцугоў, дзве пары праймераў, dNTP, а таксама іёны кальцыя і магнію і буферныя сістэмы.

Прынцып ампліфікацыі выцяснення ланцуга заснаваны на хімічна мадыфікаванай паслядоўнасці распазнання эндануклеазы рэстрыкцыі на абодвух канцах ДНК-мішэні.Эндануклеаза адкрывае шчыліну ў ланцугу ДНК у месцы яе распазнавання, а ДНК-палімераза пашырае шчыліну 3'-канец і замяняе наступны ланцуг ДНК.

Замененыя адзінкавыя ланцугі ДНК могуць быць аб'яднаны з праймерамі і пашыраны ў двайныя ланцугі з дапамогай ДНК-палімеразы.Гэты працэс паўтараецца бесперапынна, так што мэтавая паслядоўнасць эфектыўна ўзмацняецца.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот3

Перавагі і недахопы тэхналогіі ўзмацнення выцяснення ніткі

Перавагі ПДР:

Эфектыўнасць узмацнення высокая, час рэакцыі кароткі, спецыфічнасць моцная, спецыяльнае абсталяванне не патрабуецца.

Недахопы ПДР:

Прадукты неаднастайныя, і некаторыя одноцепочечные і двухцепочечные прадукты заўсёды вырабляюцца ў цыкле SDA, і хвасты непазбежна ўзнікнуць пры выяўленні з дапамогай электрафарэзу.

Rампліфікацыя акружнасці

Ампліфікацыя па кругу качэння (RCA) прапануецца на аснове метаду капіявання ДНК з патагенных арганізмаў з дапамогай круга качэння.Гэта адносіцца да выкарыстання адналанцуговай кальцавой ДНК у якасці матрыцы пры пастаяннай тэмпературы і спецыяльнай ДНК-палімеразы (напрыклад, Phi29) ) Пад дзеяннем кацільнага круга адбываецца сінтэз ДНК для дасягнення ампліфікацыі гена-мішэні.

RCA можна падзяліць на лінейнае ўзмацненне і экспанентнае ўзмацненне.ККД лінейнага RCA можа дасягаць 105разоў, а эфектыўнасць экспанентнага RCA можа дасягаць 109разы.

Простае адрозненне, як паказана на малюнку ніжэй, лінейнае ўзмацненне a выкарыстоўвае толькі 1 праймер, экспанентнае ўзмацненне b мае 2 праймеры.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот4

Лінейны RCA таксама называюць адзінкавым праймерам RCA.Праймер звязваецца з кальцавой ДНК і падаўжаецца пад дзеяннем ДНК-палімеразы.Прадукт уяўляе сабой лінейную адну нітку з вялікай колькасцю паўтаральных паслядоўнасцяў, даўжыня якіх у тысячы разоў перавышае даўжыню адной пятлі.

Так як прадукт лінейнага RCA заўсёды падлучаны да стартавага праймера, лёгкая фіксацыя сігналу з'яўляецца галоўнай перавагай.

Экспанентная RCA, таксама вядомая як гіперразгалінаваная ампліфікацыя HRCA (Hyper разгалінаваная RCA), у экспанентнай RCA адзін праймер узмацняе прадукт RCA, другі праймер гібрыдызуецца з прадуктам RCA і пашыраецца, і замена ўжо звязана з прадуктам RCA. Ніжэйшыя праймеры пашыраюць ланцуг і паўтараюць падаўжэнне і замену, каб атрымаць дендрытны прадукт узмацнення RCA.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот5

Перавагі і недахопы ампліфікацыі нуклеінавых кіслот па крузе

Перавагі RCA:

Высокая адчувальнасць, добрая спецыфічнасць і лёгкае кіраванне.

Недахопы RCA:

Фонавыя праблемы падчас выяўлення сігналу.Падчас рэакцыі RCA нецыркулявалы зонд замка і шаблонная ДНК або РНК незвязанага зонда могуць ствараць некаторыя фонавыя сігналы. 

Nампліфікацыя на аснове паслядоўнасці нуклеінавай кіслаты

Ампліфікацыя на аснове паслядоўнасці нуклеінавых кіслот (NASBA) - гэта новая тэхналогія, распрацаваная на аснове ПЦР.Гэта бесперапынная ізатэрмічная ампліфікацыя нуклеінавых кіслот, якая кіруецца парай праймераў з паслядоўнасцю промотора Т7.Тэхналогія можа ўзмацніць матрычную РНК прыкладна ў 109 разоў прыкладна за 2 гадзіны, што ў 1000 разоў вышэй, чым пры звычайным метадзе ПЦР, і не патрабуе спецыяльнага абсталявання.

Гэтая тэхналогія была выкарыстана для хуткай дыягностыкі захворванняў, як толькі яна з'явілася, і многія кампаніі ў цяперашні час выкарыстоўваюць гэты метад у наборах для выяўлення РНК.

Хоць для ампліфікацыі РНК таксама можна выкарыстоўваць тэхналогію ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй, NASBA мае свае перавагі: яе можна праводзіць пры адносна пастаяннай тэмпературы, яна больш стабільная і дакладная, чым традыцыйная тэхналогія ПЦР.

Рэакцыя адбываецца пры тэмпературы 41 градус Цэльсія і патрабуе зваротнай транскрыптазы AMV (вірус міелабластозу птушак), РНКазы Н, РНК-палімеразы Т7 і пары праймераў.

Працэс у асноўным уключае:

Прамы праймер змяшчае камплементарную паслядоўнасць промотора Т7.Падчас рэакцыі прамы праймер звязваецца з ланцугом РНК і каталізуецца ферментам AMV з адукацыяй двайнога ланцуга ДНК-РНК.

РНКаза H расшчапляе РНК у гібрыднай двухланцужковай ДНК і захоўвае адналанцужковую ДНК.

Пад дзеяннем зваротнага праймера і фермента AMV утвараецца двайны ланцуг ДНК, які змяшчае паслядоўнасць промотора Т7.

Пад дзеяннем РНК-полимеразы Т7 завяршаецца працэс транскрыпцыі і выпрацоўваецца вялікая колькасць мэтавай РНК.

Тэхналогія ізатэрмічнай ампліфікацыі нуклеінавых кіслот6

Перавагі NASBA:

(1) Яго праймер мае паслядоўнасць промотора Т7, але чужародная двухцепочечная ДНК не мае паслядоўнасці промотора Т7 і не можа быць амплифицирована, таму гэтая тэхналогія мае высокую спецыфічнасць і адчувальнасць.

(2) NASBA непасрэдна ўключае працэс зваротнай транскрыпцыі ў рэакцыю ампліфікацыі, скарачаючы час рэакцыі.

Недахопы NASBA:

(1) Кампаненты рэакцыі больш складаныя.

(2) Для павышэння кошту рэакцыі неабходны тры віды ферментаў.


Час публікацыі: 6 жніўня 2021 г