1. Вызначце абсорбцыю раствора РНК
Паглынанне пры 280, 320, 230 і 260 нм уяўляе адпаведна значэнні нуклеінавай кіслаты, фону (мутнасці раствора), канцэнтрацыі солі і арганічных рэчываў, такіх як бялок.Звычайна глядзіце толькі на OD260/OD280 (суадносіны, R).Калі 1,8~2,0, мы лічым, што забруджванне бялком або іншымі арганічнымі рэчывамі ў РНК можна дапусціць, але варта адзначыць, што калі трыс выкарыстоўваецца ў якасці буфера для вызначэння паглынальнай здольнасці, значэнне R можа быць большым за 2 (звычайна яно павінна быць <2,2).Калі R<1,8, забруджванне бялком або іншымі арганічнымі рэчывамі ў растворы больш відавочнае, і лёс РНК можна вызначыць у адпаведнасці з патрэбамі.Калі R>2,2, гэта азначае, што РНК была гидролизована ў адну нуклеінавую кіслату.
2. Электрафарэтычная карціна РНК
Як правіла, для электрафарэзу РНК выкарыстоўваецца дэнатуруючы гель, але калі ён прызначаны толькі для вызначэння якасці РНК, дэнатурацыйны гель не патрэбны, можна выкарыстоўваць звычайны агарозны гель.Мэтай электрафарэзу з'яўляецца выяўленне цэласнасці палос 28S і 18S і іх суадносін, або цэласнасці мазка мРНК.Як правіла, калі паласы 28S і 18S яркія, выразныя і рэзкія (кантры палос выразныя), а яркасць 28S больш чым удвая большая, чым у паласы 18S, мы лічым, што якасць РНК добрая.
Вышэй прыведзены два метады, якія мы звычайна выкарыстоўваем, але ні адзін з гэтых двух метадаў не можа дакладна сказаць нам, ці ёсць рэшткавая РНКаза ў растворы РНК.Калі ў растворы прысутнічае вельмі невялікая колькасць РНКазы, нам цяжка выявіць яе з дапамогай вышэйапісанага метаду, але большасць наступных ферментатыўных рэакцый праводзяцца пры тэмпературы вышэй за 37 градусаў і на працягу доўгага часу.Такім чынам, калі ў растворы РНК знаходзіцца вельмі малая колькасць РНКазы, то будзе вельмі падыходнае асяроддзе і час, каб адыграць сваю ролю ў наступных эксперыментах, і, вядома, эксперымент у гэты час будзе халодным.Ніжэй мы прадстаўляем метад, які можа пацвердзіць, ці ёсць рэшткавая РНКаза ў растворы РНК.
3. Тэст на захаванне цяпла
У адпаведнасці з канцэнтрацыяй узору, выцягніце два 1000 нг РНК з раствора РНК і дадайце яго ў цэнтрыфужную прабірку аб'ёмам 0,5 мл і дадайце трыс-буфер pH 7,0 да агульнага аб'ёму 10 мкл, а затым зачыніце вечкам прабіркі.Адну з іх пастаўце на вадзяную лазню з пастаяннай тэмпературай 70 ° С і трымаеце ў цяпле 1 гадзіну.Астатнюю частку захоўвалі ў халадзільніку пры -20°С на працягу 1 гадзіны.Па заканчэнні часу выміце дзве пробы для электрафарэзу.Пасля завяршэння электрафарэзу параўнайце іх электрафарэтычныя паласы.Калі палосы абодвух супадаюць або не маюць істотнай розніцы (вядома, іх паласы таксама адпавядаюць умовам метаду 2), гэта азначае, што ў растворы РНК няма рэшткавага забруджвання РНКазой, а якасць РНК вельмі добрая.Наадварот, калі ўзор, інкубаваны пры 70°C, дэманструе відавочную дэградацыю, гэта сведчыць аб наяўнасці забруджвання РНКазы ў растворы РНК.
2 Эксперыментальныя метады і метады экстракцыі РНК
Праблемы, з якімі мы часта сутыкаемся пры экстракцыі РНК: (1) нізкі выхад РНК;(2) РНК мае сур'ёзнае забруджванне соллю;(3) РНК мае сур'ёзнае забруджванне арганічнымі растваральнікамі;(4) дэградацыя выбаркі і іншыя праблемы
1. Звычайна выкарыстоўваюцца рэагенты для экстракцыі агульнай РНК
Метад гуанідынізаціацыянату і метад Трызола з'яўляюцца найбольш часта выкарыстоўванымі метадамі экстракцыі сумарнай РНК з тканак і клетак жывёл.Гэта асабліва падыходзіць для невялікіх узораў і тканін, якія асабліва цяжка здабываць, такіх як вылучэнне сумарнай РНК са скуры труса і злучальнай тканіны жывёл;акрамя таго, Trizol, як рэагент для лізіс агульнага прызначэння, таксама можа быць выкарыстаны для экстракцыі раслінных тканін, бактэрый, грыбоў і іншых тканін.Для раслінных тканін, якія змяшчаюць поліцукрыды і поліфенолы, такіх як алейная камелія, лісце гарбаты, насенне рапсу і г.д., метад CTAB таксама можа быць выкарыстаны для экстракцыі агульнай РНК.
У якасці звычайнага метаду метад падвойных калонак таксама вельмі папулярны з-за нармальнай працы пры тэмпературы, адсутнасці неабходнасці дабаўлення РНКазы і бяспекі - без хлараформу, фенолаў і іншых арганічных рэагентаў для экстракцыі.(рэкамендаваныя прадукты )
2. Вылучэнне сумарнай РНК з тканак жывёл
(1) Старайцеся выбіраць свежую сурвэтку, калі яна не свежая (пажадана на працягу трох месяцаў - у халадзільніку пры тэмпературы 80 ℃ або замарожаную ў вадкім азоце. Разразаючы сурвэтку, не разразайце яе непасрэдна пры пакаёвай тэмпературы, абавязкова кладзіце яе на скрыню для лёду, старайцеся пазбягаць паўторнага замарожвання і адтавання.
(2) Выкарыстоўвайце чыстыя нажніцы і пінцэт, каб адрэзаць невялікі кавалачак тканіны, паспрабуйце выразаць цэнтральную частку тканіны пры выразанні ўзору або спачатку адрэжце вялікі кавалак тканіны ад сярэдзіны, а затым адрэжце ўзор у месцы новага разрэзу.Выдаленую тканіну трэба цалкам здрабніць, змясціць здробненую тканіну ў прабірку EP без РНКазы, дадаць лізат, здробненую тканіну трэба цалкам падвяргаць уздзеянню лізата і падрыхтаваць да гамагенізацыі.
(3) Для нармальных тканін абярыце тканіны памерам з фасолю маш (30-60 мг) для гамагенізацыі.Калі тканіны ўтрымліваюць вялікую колькасць бялку, тлушчу або шчыльных фіброзных тканін, такіх як печань, належным чынам павялічце або паменшыце колькасць разрэзаных тканін (неабавязкова) Выберыце 10~20 мг).
(4) Калі мышца рыбы, мяса крэветак, медузы і іншыя тканіны з высокім утрыманнем вады здабываюцца, аб'ём пробы павінен быць адпаведна павялічаны (рэкамендуецца 100-200 мг).
(5) Калі дазваляюць умовы, тканіна жывёлы можа быць непасрэдна экстрагаваная пасля гамагенізацыі з дапамогай высокапраходнага гамагенізатара тканін, калі такога абсталявання няма.
(6) РНК, атрыманую пасля канчатковай экстракцыі, неабходна неадкладна змясціць у скрыню для лёду, каб паменшыць дэградацыю РНК.
3. Вылучэнне РНК клетак жывёл
(1) Суспензія клетак: цэнтрыфугуйце непасрэдна і выкіньце асяроддзе, прамыйце стэрыльным PBS 1-2 разы, затым суспензію з адпаведнай колькасцю PBS, а затым дадайце лізат для лізісу.Не дадавайце лізат непасрэдна ў асаджаныя клеткі пасля поўнага выдалення вадкасці.Гэта прывядзе да таго, што пакет гістонаў, які вызваляецца пасля лізаваных клетак на вонкавым пласце, прыліпне да вонкавага боку асаджаных клетак, тым самым абмяжоўваючы кантакт клетак унутры асадка з лізатам., што прыводзіць да няпоўнага лізісу клетак і зніжэння выхаду РНК.
(2) Клеткі, якія з'яўляюцца напаўадгезійнымі або непрыліплымі: пасля выкідання асяроддзя прамыйце PBS 1-2 разы, затым непасрэдна паглыніце адпаведную колькасць PBS і прадзьмухайце чашку з культурай піпеткай або пісталетам, каб здзьмуць клеткі і перанесці іх у клеткі без РНК.Дадайце лізат у прабірку EP з ферментам для экстракцыі.
(3) Адгезійныя клеткі: спачатку іх трэба расварыць трыпсінамі, затым сабраць у прабіркі EP без РНКазы, цэнтрыфугаваць для выдалення супернатанту, прамыць 1-2 разы PBS для выдалення лішку трыпсінаў і рэсуспендаваць з адпаведнай колькасцю PBS. Затым перайсці да этапу экстракцыі.
4. Вылучэнне РНК раслін
Раслінныя тканіны багатыя фенольнымі злучэннямі, або багатыя поліцукрыдамі, або ўтрымліваюць некаторыя неапазнаныя другасныя метабаліты, або маюць высокую актыўнасць РНКазы.Гэтыя рэчывы шчыльна спалучаюцца з РНК пасля лізісу клетак з адукацыяй нерастваральных комплексаў або калоідных ападкаў, якія цяжка выдаліць.Такім чынам, калі мы здабываем тканіны раслін, нам трэба выбраць набор для раслін.Лізат ў камплекце дазваляе эфектыўна вырашаць праблемы лёгкага акіслення поліфенолаў і падзелу поліцукрыдных злучэнняў і нуклеінавых кіслот.
(Для экстракцыі расліннай РНК поліцукрыдаў поліфенолаў рэкамендуюцца прадукты:
(1) Лупіну, мякаць, насенне, лісце і г.д. расліны трэба цалкам расцерці ў ступцы.У працэсе драбнення неабходна своечасова папаўняць вадкі азот, каб пазбегнуць расплаўлення ўзору.Здробнены ўзор трэба хутка дадаць да лізату і ўзбоўтаць, каб пазбегнуць дэградацыі РНК.
(2) Для ўзбагачаных клятчаткай узораў, такіх як лісце рысу і пшаніцы, колькасць экстракцыі павінна быць адпаведным чынам зменшана, у адваротным выпадку драбненне і лізіс тканін не будуць поўнымі, што прывядзе да нізкага выхаду экстрагаванай РНК.
(3) Для раслінных тканак з высокім утрыманнем вады, такіх як плады граната, плады кавуна, плады персіка і г.д., памер выбаркі павінен быць адпаведна павялічаны (100-200 мг неабавязкова).
(4) Тканкам раслін, такім як лісце раслін, карэнішчы, цвёрдыя плады і іншыя матэрыялы, звычайна рэкамендуецца выкарыстоўваць вадкі азот, каб старанна растаўчы інгрэдыенты ў ступцы, а затым перайсці да этапу экстракцыі.Звычайныя гамагенізатары тканін могуць быць неэфектыўнымі ў гамагенізацыі раслінных тканін і, як правіла, не рэкамендуюцца.
5. Меры засцярогі пры экстракцыі РНК
(1) Узоры тканін павінны быць як мага больш свежымі, каб пазбегнуць паўторнага замарожвання і адтавання.
(2) Тканіна павінна быць цалкам здробнена падчас экстракцыі, і колькасць тканіны не павінна быць занадта мала, не кажучы ўжо пра занадта шмат.
(3) Пасля дадання лізата неабходна даць дастатковы час інкубацыі для поўнага лізавання ўзору.
(4) Пры выкарыстанні метаду Trizol для экстракцыі прынцып паглынання супернатанту пасля стратыфікацыі такі: "аддаюць перавагу ўдыхаць менш, чым удыхаць больш", і нельга экстрагаваць да сярэдняга пласта, інакш гэта прывядзе да сур'ёзнага забруджвання геномнай ДНК.
(5) Пры мыцці вадкасць для мыцця павінна цалкам пранікнуць вакол сценкі трубкі, каб забяспечыць дбайнае мыццё.
(6) Для метаду экстракцыі калоны, у дадатак да аддзялення калоны пасля прамывання, адсарбцыйная калона таксама павінна быць змешчана ў звышчыстую лаўку і прадзьмута на працягу 5-10 хвілін для поўнага выпарэння арганічнага растваральніка дасуха.
(7) Пры апошняй элюцыі метадам калонкі пасля дадання вады DEPC яе трэба інкубаваць на працягу 3-5 хвілін або ваду DEPC трэба загадзя нагрэць да 60°C, каб павялічыць выхад элюцыі.У традыцыйным метадзе расшчаплення Трызола і асаджэння ў ізапрапаноле канчатковая РНК раствараецца ў вадзе DEPC, таму для растварэння трэба даць адпаведны час, а дно цэнтрыфужнай прабіркі трэба бесперапынна прадзьмухваць наканечнікам піпеткі.
3 ТПрычыны і рашэнні для нізкай канцэнтрацыі РНК/дрэннай якасці
1. Ураджайнасць занадта нізкая
Вынятага ўзору занадта мала, агульнай колькасці недастаткова, або вынятага ўзору занадта шмат і лізіс не завершаны;тканіна або клеткі адпаведнай якасці павінны быць выкарыстаны для экстракцыі, папярэдняя апрацоўка ўзору павінна быць зроблена добра, і лізіс павінен быць дастатковым.
2. Рэшткі геному
Пры экстракцыі метадам Trizol, калі супернатант ўсмоктваецца ў сярэдні пласт пасля напластавання, будзе выклікана сур'ёзнае забруджванне геному;неабходна выконваць асаблівую асцярожнасць пры кладцы слаёў, каб пазбегнуць засмоктвання ў сярэдні пласт.Калі для экстракцыі выкарыстоўваецца калонкавы метад, для экстракцыі можна выбраць набор, які змяшчае ДНКазу I.Нуклеінавая кіслата, адсарбаваная на мембране, непасрэдна пераварваецца ДНКазай I, што можа значна паменшыць рэшткі ДНК.
3. Дэградацыя РНК
Гэта можа быць дэградацыя самога вынятага ўзору або дэградацыя, выкліканая падчас працэсу экстракцыі;наколькі гэта магчыма, свежыя ўзоры павінны быць выкарыстаны для экстракцыі РНК, і сабраныя ўзоры павінны захоўвацца ў вадкім азоце або ў халадзільніку -80°C, і варта пазбягаць паўторнага замарожвання і размарожвання.У працэсе экстракцыі РНК павінны выкарыстоўвацца наканечнікі без РНКаз/ДНКаз, цэнтрыфужныя прабіркі і іншыя матэрыялы.Працэс экстракцыі павінен быць максімальна хуткім.Вынятую РНК трэба змясціць у скрыню для лёду і захоўваць пры тэмпературы -80.Калі экстрагированную РНК неабходна выявіць з дапамогай гель-электрафарэзу, то электрафарэз неабходна правесці адразу пасля экстракцыі, а буфер для электрафарэзу замяніць зноў прыгатаваным.
4. Рэшткі солі і арганічных растваральнікаў
Рэагенты для экстракцыі ўтрымліваюць солі фенолу і гуанідзіну, а прамыўны раствор - этанол.У працэсе экстракцыі лізат не быў цалкам паглынуты і выкінуты, а прамыўны раствор не быў цалкам высушаны.Рэшткі соляў і арганічных растваральнікаў шкодныя для наступнай зваротнай транскрыпцыі і ПЦР.Розныя ступені інгібіравання, таму тканкавы лізат павінен быць цалкам выдалены ў працэсе экстракцыі, а прамыванне павінна быць дастатковым, каб можна было прамыць навакольныя сценкі трубкі.Акрамя таго, трубка апаражняецца і прадзьмухваецца - неабходны этап, які яшчэ больш паменшыць рэшткі арганічных рэчываў.
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб экстракцыі РНК, калі ласка, сачыце за нашым вэб-сайтам:
www.foreivd.com для атрымання дадатковай інфармацыі.
Час публікацыі: 1 снежня 2022 г
