Флуарэсцэнтная колькасная ПЦР (таксама вядомая як TaqMan ПЦР, далей FQ-ПЦР) - гэта новая тэхналогія колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот, распрацаваная PE (Perkin Elmer) у Злучаных Штатах у 1995 г. Гэтая тэхналогія заснавана на звычайнай ПЦР з даданнем флуарэсцэнтна пазначаных зондаў.У параўнанні з гнуткай ПЦР, FQ-ПЦР мае шмат пераваг для рэалізацыі сваёй колькаснай функцыі.Гэты артыкул мае намер коратка апісаць характарыстыкі, прынцыпы, метады і прымяненне тэхналогіі.
1 Асаблівасці
FQ-PCR не толькі мае высокую адчувальнасць звычайнай ПЦР, але таксама з-за прымянення флуоресцентных зондаў, ён можа непасрэдна выяўляць змяненне флуоресцентного сігналу падчас ПЦР-ампліфікацыі праз сістэму фотаэлектрычнай праводнасці для атрымання колькасных вынікаў, што пераадольвае многія недахопы звычайнай ПЦР, таму ён таксама мае высокую спецыфічнасць гібрыдызацыі ДНК і высокую дакладнасць тэхналогіі спектраскапіі.
Напрыклад, агульныя прадукты ПЦР неабходна кантраляваць з дапамогай электрафарэзу ў агарозным гелі і афарбоўвання бромістым этидием ультрафіялетавым святлом або электрафарэзу ў поліакрыламідным гелі і афарбоўвання срэбрам.Гэта патрабуе не толькі некалькіх інструментаў, але і часу і намаганняў.Плямы, якія выкарыстоўваюцца брамістым этидием, шкодныя для чалавечага арганізма, і гэтыя складаныя эксперыментальныя працэдуры ствараюць магчымасці для забруджвання і ілжывых спрацоўванняў.Аднак для FQ-PCR трэба толькі адзін раз адкрыць вечка падчас загрузкі ўзору, а наступны працэс - гэта праца ў цалкам закрытай прабірцы, якая не патрабуе пост-апрацоўкі ПЦР, што дазваляе пазбегнуць многіх недахопаў звычайных аперацый ПЦР.У эксперыменце звычайна выкарыстоўваецца термоциклер ПЦР ABI7100, распрацаваны кампаніяй PE.
Прыбор мае наступныя характарыстыкі: ① Шырокае прымяненне: яго можна выкарыстоўваць для колькаснага вызначэння прадуктаў ПЦР ДНК і РНК, даследавання экспрэсіі генаў, выяўлення патагенаў і аптымізацыі ўмоў ПЦР.② Унікальны колькасны прынцып: пры выкарыстанні флуарэсцэнтна пазначаных зондаў колькасць флуарэсцэнцыі будзе назапашвацца ў цыкле ПЦР пасля лазернага ўзбуджэння, каб дасягнуць мэты колькаснага вызначэння.③ Высокая эфектыўнасць працы: убудаваны тэрмацыклер 9600 ПЦР, кіраваны кампутарам ад 1 да 2 гадзін для аўтаматычнага і сінхроннага завяршэння ампліфікацыі і колькаснага вызначэння 96 узораў.④ Няма неабходнасці ў электрафарэзе ў гелі: няма неабходнасці ў развядзенні і электрафарэзе ўзору, проста выкарыстоўвайце спецыяльны зонд для выяўлення непасрэдна ў рэакцыйнай прабірцы.⑤Няма забруджвання ў трубаправодзе: прыняты ўнікальная цалкам закрытая рэакцыйная трубка і сістэма фотаэлектрычнай праводнасці, таму няма неабходнасці турбавацца аб забруджванні.⑥Вынікі ўзнаўляльныя: колькасны дынамічны дыяпазон складае да пяці парадкаў.Таму, паколькі гэтая тэхналогія была паспяхова распрацавана, яна была ацэнена многімі навуковымі даследчыкамі і прымянялася ў многіх галінах.
2 Прынцыпы і метады
Прынцып працы FQ-PCR заключаецца ў выкарыстанні 5′→3′ экзануклеазнай актыўнасці фермента Taq для дадання флуарэсцэнтна пазначанага зонда ў рэакцыйную сістэму ПЦР.Зонд можа спецыяльна гібрыдызавацца з шаблонам ДНК, які змяшчаецца ў паслядоўнасці праймера.5'канец зонда пазначаны генам выпраменьвання флуарэсцэнцыі FAM (6-карбаксіфлуарэсцэнін, пік выпраменьвання флуарэсцэнцыі пры 518 нм), а 3'канец пазначаны групай гашэння флуарэсцэнцыі TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, пік выпраменьвання флуарэсцэнцыі пры 582 нм), 3'-пачатак зонда фасфарылюецца, каб прадухіліць падаўжэнне зонда падчас ПЦР-ампліфікацыі.Калі зонд застаецца непашкоджаным, група гасільніка душыць флуарэсцэнтнае выпраменьванне выпраменьвальнай групы.Пасля таго, як выпраменьвальная група аддзяляецца ад гашаючай групы, інгібіраванне здымаецца, і аптычная шчыльнасць пры 518 нм павялічваецца і выяўляецца сістэмай дэтэктавання флуарэсцэнцыі. У фазе рэнатурацыі зонд гібрыдызуецца з матрычнай ДНК, і фермент Taq у фазе падаўжэння рухаецца ўздоўж шаблону ДНК з падаўжэннем праймера.Калі зонд адсякаецца, эфект тушэння вызваляецца і флуоресцентный сігнал вызваляецца.Кожны раз, калі шаблон капіюецца, зонд адсякаецца, што суправаджаецца вылучэннем флуоресцентного сігналу.Паколькі паміж колькасцю выпушчаных флюарафораў і колькасцю прадуктаў ПЦР існуе адназначная залежнасць, гэты метад можа быць выкарыстаны для дакладнага колькаснага вызначэння шаблону.Эксперыментальны прыбор звычайна выкарыстоўвае термоциклер ABI7100 ПЦР, распрацаваны кампаніяй PE, а таксама можна выкарыстоўваць іншыя термоциклеры.Калі для эксперыменту выкарыстоўваецца рэакцыйная сістэма тыпу ABI7700, пасля завяршэння рэакцыі колькасныя вынікі можна атрымаць непасрэдна з дапамогай камп'ютэрнага аналізу.Калі вы выкарыстоўваеце іншыя термоциклеры, вам трэба выкарыстоўваць дэтэктар флуарэсцэнцыі для вымярэння сігналу флуарэсцэнцыі ў рэакцыйнай трубцы адначасова для разліку RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ уяўляе сабой стаўленне інтэнсіўнасці люмінесцэнцыі групы флуарэсцэнтнага выпраменьвання прабіркі з узорам да інтэнсіўнасці люмінесцэнцыі групы тушэння, RQ- уяўляе суадносіны гэтых двух у пустой прабірцы, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) уяўляе сабой колькасць змены сігналу флуарэсцэнцыі падчас ПЦР. Пасля апрацоўкі даных можна атрымаць колькасныя вынікі.За кошт увядзення люмінесцэнтных зондаў значна павышаецца спецыфічнасць эксперыменту.Канструкцыя зонда звычайна павінна адпавядаць наступным умовам: ①Даўжыня зонда павінна складаць каля 20-40 асноў, каб забяспечыць спецыфічнасць звязвання.②Змест асноў GC складае ад 40% да 60%, каб пазбегнуць дубліравання адзінкавых нуклеатыдных паслядоўнасцей.③ Пазбягайце гібрыдызацыі або накладання з праймерамі.④ Стабільнасць звязвання паміж зондам і шаблонам большая, чым стабільнасць звязвання паміж праймерам і шаблонам, таму значэнне Tm зонда павінна быць як мінімум на 5°C вышэй, чым значэнне Tm праймера.Акрамя таго, канцэнтрацыя зонда, гамалогія паміж зондам і матрычнай паслядоўнасцю, а таксама адлегласць паміж зондам і праймерам - усё гэта ўплывае на вынікі эксперыменту.
Спадарожныя тавары:
Кітай ПЦР у рэальным часе Easyᵀᴹ-Taqman Вытворца і пастаўшчык |Foregene (foreivd.com)
Час публікацыі: 15 кастрычніка 2021 г
