РНКаза - гэта далікатнае слова, якое многія студэнты, якія часта праводзяць эксперыменты па экстракцыі РНК, не хочуць чуць.У поўным узбраенні РНК, якая была канчаткова выдзелена высокатаксічнымі рэагентамі фенолам і хлараформам, дэградавала.Я не змірыўся!!!Сёння давайце паглядзім на паходжанне знакамітай Rnase.

Рыбануклеаза (РНКаза), або РНКаза, - гэта нуклеаза, якая можа гідралізаваць РНК на невялікія малекулы.РНКаза, як маламалекулярны бялок, незвычайна стабільная .Звычайная паравая стэрылізацыя пры высокай тэмпературы і высокім ціску і бялковыя інгібітары не могуць цалкам дэзактываваць яго.Стабільнасць РНКазы ў асноўным абумоўлена дысульфіднымі сувязямі ў структуры.Напрыклад, звычайна выкарыстоўваная РНКаза падстраўнікавай залозы буйной рагатай жывёлы мае толькі 124 амінакіслоты, але змяшчае 4 дысульфідныя сувязі.Серная сувязь і дысульфідная сувязь надзяляюць РНКазу выдатнай тэрмічнай стабільнасцю.Акрамя таго, Рназа мае адносна невялікую малекулярную масу і ў многіх выпадках можа хутка аднавіць сваю зыходную канфармацыю.

Акрамя надзвычайнай стабільнасці,РНКазы паўсюдна сустракаюцца ў лабараторыі .РНКаза - гэта механізм біялагічнай абароны.Для клеткі экзагенная РНК часта бывае фатальнай.У параўнанні з экзагеннай ДНК, экзагенная РНК часта больш небяспечная.РНК з задавальненнем транскрыбуецца і транслюецца, таму амаль ва ўсіх арганізмах эвалюцыянавалі РНКазы для абароны ад уварвання экзагеннай РНК.Такім чынам, бактэрыяльныя клеткі, якія культывуюцца ў лабараторыі, і вы, хто здабывае РНК, вылучаюць водар РНКазы.Вадкасці арганізма чалавека (сліна, слёзы і г.д.) утрымліваюць вялікую колькасць РНКазы, таму не плачце, калі РНК дэградуе.Чым больш вы плачаце, тым горш дэградацыя РНК!!Сястра Дайю не падыходзіць для экстракцыі РНК!

Акрамя таго, ваша далікатная скура таксама змяшчае шмат РНКазы, і маркеры, піпеткі, дзверцы халадзільніка і дзвярныя ручкі, да якіх дакраналася скура, таксама ўтрымліваюць РНКазу.

У сувязі з такой колькасцю блуканняў, давайце паглядзім, як змагацца з РНКазамі.

Першае, пра што кожны думае пры выдаленні РНКDEPC(диэтилпирокарбонат).DEPC у асноўным дэнатуруе бялок шляхам злучэння з імідазолавым кольцам актыўнай групы РНКазы гістыдыну, тым самым інгібіруючы актыўнасць фермента.0,1% DEPC можа мець лепшы эфект выдалення Рназы, але мы павінны звярнуць увагу, што DEPC з'яўляецца вядомым канцэрагенам, таму пры яго выкарыстанні трэба звярнуць асаблівую ўвагу.

Для РНКазы нам трэба зыходзіць з двух аспектаў,першы - інгібіраваць актыўнасць эндагеннай РНКазы

Звычайныя рэагенты для экстракцыі РНК, такія як гуанідынізатыяцыянат і ДТТ, якія змяшчаюцца ў Трызоле, могуць размыкаць дысульфідную сувязь РНКазы, але ёсць яшчэ некаторыя РНКазы, асабліва ва ўзорах тканін, таму звярніце ўвагу на нізкую тэмпературу.

1.Неадкладна апусціце ўзор тканіны ў вадкі азот пасля яго вымання або ў камерцыйны раствор для захавання РНК.

2.Пасля экстракцыі РНК з клетачнага ўзору дадайце яе ў раствор для лізісу і лізіруйце на скрыні для лёду

3. Для драбнення лепш за ўсё выкарыстоўваць вадкі азот калі ўзоры тканін гамагенізуюць.Пры выкарыстанні электрычнага гамагенізатара без вадкага азоту звярніце ўвагу на поўнае папярэдняе астуджэнне адаптара гамагенату.

Другая - экзагенная ДНКаза

1.Будзьце ў поўным узбраенні, надзеньце лабараторны халат, надзеньце маску і не забудзьцеся надзець пару новых пальчатак (не будзьце такімі эканомнымі!! Варта адзначыць, што Трызол вельмі едкі, а таксама вельмі моцны ў пальчатках, таму не капайце на рукі).

2.Усе выкарыстаныя наканечнікі піпетак, прабіркі для EP, прабіркі для ПЦР і іншае абсталяванне неабходна апрацаваць дэ-РНКазай.Яго можна замачыць у 0,1% DEPC, а затым націснуць пад высокім ціскам.Звярніце ўвагу на працу ў выцяжной шафе.Мясцовыя тыраны могуць напрамую купляць расходныя матэрыялы для выдалення ферментаў.

PS: Дазвольце расказаць вам лянівы метад.Хоць высокая тэмпература і высокі ціск не могуць цалкам выдаліць РНКазу, яны выдаляць значную яе частку.2 разы высокай тэмпературы і высокага ціску дае добры эфект, і экстракцыя РНК мае невялікі эфект.

3.Алкаголь можа дэнатураваць вавёркі,таму стол для экстракцыі РНК можна працерці 75% спіртам , а пальчаткі таксама можна апырскаць спіртам.

4.Канчатковы раствор для растварэння РНК і цэнтрыфужную прабірку таксама павінны быць апрацаваны дэ-РНКазай.Вада DEPC - гэта звычайна выкарыстоўваны раствор для растварэння РНК.Давайце пагаворым аб правільным спосабе падрыхтоўкі вады DEPC (не забудзьце запакаваць камерцыйную ваду DEPC, калі вы яе купляеце)

Дадайце DEPC у звышчыстую ваду ў суадносінах 1:1000, добра ўзбоўтайце, пакіньце на ноч пры 37°C і стэрылізуйце пры 121°C пры высокай тэмпературы і высокім ціску на працягу 15 хвілін.Ваду DEPC можна захоўваць пры -20°C у аліквотах па 1 мл.

Нарэшце, каб падвесці вынік: нізкая тэмпература - гэта галоўнае, расходныя матэрыялы добра абыходзяцца, у поўным узбраенні і менш размоў!

Ну вось і ўсё для сённяшняй стратэгіі.Я жадаю вам усёй канцэнтрацыі і чысціні РНК, якія вы згадалі.Абодва A260/A280 - 2.0!!!

Вядома, калі вы выкарыстоўваеце aнабор для экстракцыі РНК пры пакаёвай тэмпературы, вы можаце не сутыкнуцца з вышэйзгаданымі праблемамі.

Аперацыя пры пакаёвай тэмпературы без дадання ДНКазы дазваляе здабываць агульную РНК з клетак за 11 хвілін, а агульную РНК з тканак жывёл або раслін - за 30 хвілін.

Каб атрымаць пробныя ўзоры, звяртайцеся:overseas@foregene.com

Спадарожныя тавары:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/