• facebook
  • Linkedin
  • youtube

Праверка прадукцыйнасці праймераў і зондаў на ранняй стадыі ПЦР-рэагентаў і вызначэнне найбольш прыдатных умоў рэакцыі з'яўляюцца неабходнымі ўмовамі для забеспячэння бесперашкоднага ходу афіцыйных эксперыментаў.

Такім чынам, як нам трэба пацвердзіць зонд праймера на ранняй стадыі?

Асноўныя паказчыкі - базавая лінія, крывая ампліфікацыі, значэнне ct, эфектыўнасць ампліфікацыі, выяўленне ўзору з нізкай канцэнтрацыяй, CV і г.д.

Базавая лінія

Базавая лінія - гэта гарызантальная лінія на крывой ампліфікацыі ПЦР.У першыя некалькі цыклаў рэакцыі ампліфікацыі ПЦР сігнал флуарэсцэнцыі не моцна змяняецца і ўтварае прамую лінію.Гэтая прамая з'яўляецца базавай лініяй.

Пры скрынінгу ПЦР-праймер-зондаў звярніце ўвагу на тое, ці знаходзіцца базавы ўзровень на ўзроўні.Чысціня канцэнтрацыі праймернага зонда будзе ўплываць на базавую лінію, напрыклад, у выніку павышэння або паніжэння базавай лініі.Базавая лінія таксама з'яўляецца вельмі інтуітыўна зразумелым паказчыкам.
Аналіз

Крывая ўзмацнення

Яшчэ адзін інтуітыўна зразумелы паказчык - форма крывой узмацнення.Лепш за ўсё мець S-вобразную крывую, каб пазбегнуць другаснага ўзмацнення або іншых анамальных крывых узмацнення.
нуль

Значэнне Ct

Колькасць цыклаў, якая адпавядае кропцы перагіну ад базавай лініі да экспанентнага росту, з'яўляецца значэннем Ct.

Для аднаго і таго ж узору розныя праймерныя зонды прыводзяць да розных крывых узмацнення, і адпаведнае значэнне Ct будзе залежаць ад эфектыўнасці ўзмацнення і ступені перашкод.Тэарэтычна, чым меншае значэнне Ct праймера, які мы выбіраем, тым лепш.

Аналіз-3

Эфектыўнасць узмацнення

Адным з найбольш надзейных і стабільных метадаў ацэнкі эфектыўнасці ПЦР-ампліфікацыі з'яўляецца стандартная крывая, якая таксама шырока прызнана даследчыкамі.Метад прадугледжвае стварэнне серыі ўзораў для кантролю адноснай колькасці мэтавых шаблонаў.Гэтыя ўзоры звычайна вырабляюцца шляхам серыйных развядзенняў канцэнтраваных асноўных раствораў, найбольш часта выкарыстоўваецца 10-кратнае развядзенне.Выкарыстанне серыі разведзеных узораў, выкарыстанне стандартнай праграмы qPCR для ампліфікацыі для атрымання значэння Cq і, нарэшце, малюнак стандартнай крывой у залежнасці ад канцэнтрацыі кожнага ўзору і адпаведнага значэння Cq, каб атрымаць лінейнае ўраўненне Cq= -klgX0+b і эфектыўнасць ампліфікацыі E=10(-1 /k)-1.Пры выкарыстанні кПЦР для колькаснага аналізу эфектыўнасць ампліфікацыі павінна быць у дыяпазоне 90%-110% (3,6>k>3,1).

Аналіз-4

Выяўленне ўзораў з нізкай канцэнтрацыяй

Калі канцэнтрацыя ўзору нізкая, хуткасць выяўлення розных праймераў адрозніваецца.Мы выбіраем 20 узораў з нізкай канцэнтрацыяй для рэплікацыі, і сістэма праймер-зонд з самай высокай хуткасцю выяўлення з'яўляецца лепшай.

Аналіз-5

Каэфіцыент варыяцыі (CV)

10 дублікатаў узораў можна выявіць рознымі праймернымі зондамі ў адпаведнасці са стандартам лініі рэагента для выяўлення ампліфікацыі нуклеінавых кіслот.

Аналіз-6

Колькасныя рэагенты:
Дакладнасць
Дакладнасць у межах адной партыі павінна адпавядаць: каэфіцыент варыяцыі (CV,%) лагарыфмічнага значэння доследнай канцэнтрацыі складае ≤5%.Калі канцэнтрацыя ўзору нізкая, каэфіцыент варыяцыі (CV,%) лагарыфма канцэнтрацыі выяўлення складае ≤10%


Якасныя рэагенты:
Дакладнасць
Дакладнасць у адной партыі павінна адпавядаць:

(1) Каэфіцыент варыяцыі значэння Ct (CV,%) ≤5%

Адзін і той жа ўзор выпрабоўваецца паралельна 10 разоў, і вынікі выпрабаванняў павінны быць узгодненымі


Час публікацыі: 18 верасня 2021 г