Навіны - Вычарпальная інтэрпрэтацыя ключавых момантаў тэсту на нуклеінавыя кіслаты SARS-CoV-2, чаму бываюць ілжывыя адмоўныя і станоўчыя вынікі паўторнага тэсту?

На ранняй стадыі ўспышкі, з-за хуткага развіцця, хуткая дыягностыка падазраваных пацыентаў з'яўляецца ключом да прафілактыкі COVID-19.Некаторыя зацверджаныя рэагенты для выяўлення нуклеінавых кіслот маюць кароткі час распрацоўкі, і існуюць такія праблемы, як паспешнае пацвярджэнне прадукцыйнасці, недастатковая аптымізацыя рэагентаў і вялікія адрозненні паміж партыямі;Праблемы розных клінічных лабараторый у розных аспектах працэсу выяўлення нуклеінавых кіслот таксама могуць паўплываць на дакладнасць вынікаў выяўлення нуклеінавых кіслот.Гэты артыкул будзе сканцэнтраваны на ключавых сувязях і момантах у сучасным выяўленні нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2, а таксама прааналізаваны праблемы паўторнага ілжываадмоўнага і станоўчага выяўлення нуклеінавых кіслот у лабараторыі і клінічныя неадпаведнасці.

Прынцыпы выяўлення нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 - гэта РНК-вірус з паслядоўнасцю геному каля 29 кб, з 10 генамі, якія могуць эфектыўна кадзіраваць 10 бялкоў.Вірусы складаюцца з РНК і бялку, а самы знешні пласт - гэта знешняе пакрыццё, якое складаецца з ліпідаў і глікапратэінаў.Унутры бялковы капсід ахінае РНК, тым самым абараняючы РНК, якая лёгка раскладаецца (P1).

P1 Структура SARS-COV-2

Вірусы ўварваюцца ў клеткі праз спецыяльныя рэцэптары клетачнай паверхні, каб выклікаць інфекцыю, і выкарыстоўваюць клеткі-гаспадары для рэплікацыі.

Прынцып выяўлення вірусных нуклеінавых кіслот заключаецца ў экспазіцыі віруснай РНК праз клеткавы лізат, а затым у рэальным часе з выкарыстаннем флуарэсцэнтнай палімеразнай ланцуговай рэакцыі зваротнай транскрыпцыі (RT-PCR) для выяўлення.

Ключ да прынцыпу выяўлення заключаецца ў выкарыстанні праймераў і зондаў для дасягнення «мэтавага супадзення» паслядоўнасцей нуклеінавых кіслот, гэта значыць для пошуку паслядоўнасці нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2, якая адрозніваецца ад іншых вірусаў прыкладна ў 30 000 асноў (падабенства нуклеінавай кіслаты з іншымі вірусамі) «Нізкая» вобласць), дызайн праймераў і зондаў.

Праймеры і зонды добра супадаюць са спецыфічным рэгіёнам нуклеінавай кіслаты SARS-CoV-2, гэта значыць, спецыфічнасць вельмі высокая.Як толькі вынік флуоресцентной RT-PCR ампліфікацыі ўзору, які падлягае тэсціраванню, у рэжыме рэальнага часу стане станоўчым, гэта даказвае, што ва ўзоры прысутнічае SARS-CoV-2.Глядзіце P2.

P2 Этапы вызначэння нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 (флуоресцентная RT-PCR у рэальным часе)

Умовы і патрабаванні лабараторыі для выяўлення нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2

Лабараторыі тэсціравання нуклеінавых кіслот з'яўляюцца найбольш ідэальнымі для асяроддзяў з адмоўным ціскам, і яны павінны звяртаць увагу на маніторынг ціску, падтрымліваць паток паветра і выдаляць аэразолі.Персанал, які займаецца тэставаннем нуклеінавых кіслот, павінен мець адпаведную кваліфікацыю, прайсці адпаведную падрыхтоўку па палімеразнай ланцуговай рэакцыі і прайсці ацэнку.Лабараторыя павінна знаходзіцца пад строгім кантролем, а таксама асобам, якія не маюць дачынення да яе, уваход строга забаронены.Чыстая зона павінна праветрывацца і прадэзінфікаваць на месцы.Адпаведныя прадметы размяшчаюцца па зонах, чыстыя і брудныя аддзяляюцца, своечасова замяняюцца і дэзінфікуюцца на месцы.Звычайная дэзінфекцыя: хлорзмяшчальны дэзінфікуе сродак з'яўляецца асноўным рашэннем для вялікіх плошчаў, а для невялікіх плошчаў можна выкарыстоўваць 75% спірт.Добрым спосабам барацьбы з аэразолямі з'яўляецца адчыненне вокнаў для ветрання, таксама можна правесці абеззаражанне паветра з дапамогай ультрафіялетавых прамянёў, фільтрацыі і абеззаражання паветра.

Асноўныя звёны і параметры вызначэння нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 (флуоресцентная RT-PCR у рэальным часе)

Хоць лабараторыі звычайна надаюць пільную ўвагу «выяўленню» нуклеінавых кіслот, насамрэч «экстракцыя» нуклеінавых кіслот таксама з'яўляецца адным з ключавых этапаў паспяховага выяўлення, які цесна звязаны са зборам і захоўваннем узораў вірусаў.

У цяперашні час найбольш шырока выкарыстоўваюцца рэспіраторныя ўзоры, такія як мазкі з насаглоткі, выкарыстоўваюць другі метад, які ўяўляе сабой раствор для інактывацыі (кансервавання), прыгатаваны на аснове экстракцыі нуклеінавых кіслот і раствора для лізісу.З аднаго боку, гэты раствор для захавання вірусаў можа дэнатураваць бялок віруса, страціць сваю актыўнасць і больш не быць інфекцыйным, а таксама павысіць бяспеку транспарціроўкі і стадыі выяўлення;з іншага боку, ён можа непасрэдна ўзламаць вірус, каб вызваліць нуклеінавую кіслату, ліквідаваць фермент, які раскладаецца нуклеінавай кіслатой, і прадухіліць вірус.РНК дэградуе.

Раствор для ўзяцця пробы віруса, прыгатаваны на аснове экстракцыйнага лізіснага раствора нуклеінавых кіслот.The main components are balanced salts, ethylenediaminetetraacetic acid chelating agent, guanidine salt (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, etc.), anionic surfactant (dodecane) Sodium sulfate), cationic surfactant (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), phenol, 8-hydroxyquinoline, dithiothreitol, proteinase K and other several or more components.У цяперашні час існуе мноства тыпаў набораў для экстракцыі нуклеінавых кіслот, а таксама выкарыстоўваюцца розныя рэагенты для экстракцыі і ачысткі нуклеінавых кіслот.Нават калі выкарыстоўваецца адзін і той жа рэагент для экстракцыі і ачысткі нуклеінавых кіслот, працэдуры экстракцыі ў кожным наборы розныя.

У цяперашні час наборы для выяўлення нуклеінавых кіслот, зацверджаныя Нацыянальнай адміністрацыяй медыцынскіх вырабаў, адбіраюцца на аснове генаў ORF1ab, E і N у геноме SARS-CoV-2.Прынцыпы выяўлення розных прадуктаў у асноўным аднолькавыя, але іх праймеры і канструкцыі зондаў адрозніваюцца.Існуюць сегменты з адной мэтай (ORF1ab), сегменты з двума мэтамі (ORF1ab, N або E) і сегменты з трыма мэтамі (ORF1ab, N і E).Розніца паміж выяўленнем і інтэрпрэтацыяй, экстракцыяй нуклеінавых кіслот і рэакцыйнай сістэмай флуоресцентной RT-PCR у рэжыме рэальнага часу павінна разглядацца ў інструкцыях адпаведнага набору, і рэкамендуецца, каб карыстальнікі строга прытрымліваліся метаду інтэрпрэтацыі, указанага ў інструкцыях да набору для інтэрпрэтацыі.Агульныя вобласці, праймеры і паслядоўнасці зондаў, узмоцненыя флуарэсцэнтнай RT-PCR у рэальным часе, паказаны на P3.

P3 Размяшчэнне мішэні амплікона SARS-CoV-2 у геноме і паслядоўнасць праймераў і зондаў

Інтэрпрэтацыя вынікаў вызначэння нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 (RдобраTімя флуарэсцэнтнай RT-PCR)

«План прафілактыкі пнеўманіі і барацьбы з інфекцыяй SARS-CoV-2 (другое выданне)» упершыню ўдакладніў крытэрыі ацэнкі вынікаў ампліфікацыі аднаго гена:

1. Няма Ct або Ct≥40 з'яўляецца адмоўным;

2. Ct<37 станоўчы;

3. Значэнне Ct 37-40 - гэта вобласць шэрага.Эксперымент рэкамендуецца паўтарыць.Калі вынік паўторнага выканання Ct<40 і крывая ампліфікацыі мае відавочныя пікі, узор лічыцца станоўчым, у адваротным выпадку ён адмоўны».

Трэцяе выданне даведніка і чацвёртае выданне даведніка працягнулі вышэйзгаданыя крытэрыі.Аднак з-за розных мішэняў, якія выкарыстоўваюцца ў камерцыйных наборах, вышэйзгаданае 3-е выданне кіраўніцтва не дае крытэрыяў для вызначэння камбінацыі мішэняў, падкрэсліваючы, што інструкцыі, прадстаўленыя вытворцам, маюць перавагу.Пачынаючы з пятага выдання кіруючых прынцыпаў, былі ўдакладнены дзве мэты, асабліва крытэрыі ацэнкі адной мэты, якую цяжка ацаніць.Гэта значыць, калі лабараторыя хоча пацвердзіць, што выпадак станоўчы на выяўленне нуклеінавай кіслаты SARS-CoV-2, павінна быць выканана 1 з 2 умоў:

(1) Дзве мішэні SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) у адной і той жа пробе далі станоўчы вынік з дапамогай флуарэсцэнтнай RT-PCR у рэальным часе.Калі адна мішэнь аказваецца станоўчай, неабходны паўторны ўзор і аналіз.Калі вынікі тэсту з'яўляюцца. Калі адзінкавая мішэнь усё яшчэ станоўчая, яна лічыцца станоўчай.

(2) Два ўзоры флуарэсцэнтнай RT-PCR у рэжыме рэальнага часу паказалі адначасовы станоўчы вынік або два ўзоры аднаго тыпу паказалі адзіны станоўчы вынік тэсту, які можна лічыць станоўчым.Аднак у рэкамендацыях таксама падкрэсліваецца, што адмоўныя вынікі аналізу нуклеінавых кіслот не могуць выключыць заражэнне SARS-CoV-2.Неабходна выключыць фактары, якія могуць выклікаць ілжывыя адмоўныя вынікі, у тым ліку дрэнную якасць узораў (рэспіраторныя ўзоры з ротаглоткі і іншых частак), занадта ранні або занадта позні збор узораў, няправільнае захоўванне, транспарціроўку і апрацоўку ўзораў, праблемы з самой тэхналогіяй (варыяцыя віруса, інгібіраванне ПЦР) і г.д.

Прычыны ілжывых адмоў пры выяўленні SARS-CoV-2

Канцэпцыя «ілжываадмоўных» у аналізах нуклеінавых кіслот, якія разглядаюцца ў цяперашні час, часта адносіцца да «ілжыва адмоўных вынікаў», у якіх вынікі аналізаў на нуклеінавыя кіслаты не адпавядаюць клінічным праявам, гэта значыць, што клінічныя сімптомы і вынікі візуалізацыі выклікаюць падазрэнне на COVID-19, але тэсты на нуклеінавыя кіслаты заўсёды «адмоўныя» шмат разоў.У Клінічным лабараторным цэнтры Нацыянальнай камісіі па ахове здароўя патлумачылі «ілжываадмоўны» тэст на SARS-CoV-2.

(1) У клетках заражанага чалавека ёсць пэўная колькасць віруса.Існуючыя дадзеныя паказваюць, што пасля заражэння арганізма вірусам вірус пранікае ў горла праз нос і рот, затым у трахею і бронхі, а затым дасягае альвеол.Заражаны чалавек адчуе інкубацыйны перыяд, лёгкія сімптомы, а затым працэс цяжкіх сімптомаў і розныя стадыі захворвання.І колькасць віруса ў розных частках цела розная.

З пункту гледжання віруснай нагрузкі тыпаў клетак, клеткі альвеалярнага эпітэлія (ніжнія дыхальныя шляхі)> эпітэліяльныя клеткі дыхальных шляхоў (верхнія дыхальныя шляхі)> фібрабласты, эндотелиальные клеткі і макрафагі і г.д.;з тыпу ўзору, альвеалярны лаваж (самы выдатны)> мокрота пры глыбокім кашлі> мазок з насаглоткі> мазок з ротаглоткі> кроў.Акрамя таго, вірус таксама можна выявіць у кале.Аднак, улічваючы зручнасць аперацыі і прымальнасць пацыентаў, звычайна выкарыстоўваецца парадак клінічнай пробы: мазок з ротаглоткі> мазок з насаглоткі> прамыўная вадкасць бронх (складаная аперацыя) і глыбокая мокрота (звычайна сухі кашаль, цяжка атрымаць).

Такім чынам, колькасць віруса ў клетках ротоглотки або насаглоткі некаторых пацыентаў невялікая або надзвычай нізкая.Калі для даследавання браць толькі пробы ротоглотки або насаглоткі, то вірусная нуклеінавая кіслата выяўлена не будзе.

(2) Клеткі, якія змяшчаюць вірус, не былі сабраны падчас збору ўзору, або вірусная нуклеінавая кіслата не была эфектыўна захавана.

[① Няправільнае месца збору, напрыклад, пры зборы мазкоў з ротаглоткі недастатковая глыбіня збору, сабраныя мазкі з насаглоткі не збіраюцца глыбока ў насавой паражніны і г. д. Большасць сабраных клетак могуць быць свабоднымі ад вірусаў;

②Тампоны для ўзяцця проб выкарыстоўваюцца няправільна.Напрыклад, сінтэтычныя валакна, такія як поліэфірнае валакно, поліэфірнае валакно і поліпрапіленавае валакно, рэкамендуюцца для матэрыялу галоўкі тампона.Натуральныя валакна, такія як бавоўна, выкарыстоўваюцца ў рэальнай працы (моцная адсорбцыя бялку і іх няпроста вымыць) і нейлонавыя валокны (дрэннае водапаглынанне, што прыводзіць да недастатковага аб'ёму адбору пробы);

③Няправільнае выкарыстанне прабірак для захоўвання вірусаў, напрыклад, няправільнае выкарыстанне поліпрапіленавых або поліэтыленавых пластыкавых прабірак для захоўвання, якія лёгка паглынаюць нуклеінавыя кіслоты (ДНК/РНК), што прыводзіць да зніжэння канцэнтрацыі нуклеінавай кіслаты ў растворы для захоўвання.На практыцы для захоўвання вірусных нуклеінавых кіслот рэкамендуецца выкарыстоўваць палімерны пластык з поліэтылену і прапілена і некаторыя спецыяльна апрацаваныя поліпрапіленавыя пластыкавыя кантэйнеры.]

(4) Праца клінічнай лабараторыі не стандартызавана.Умовы транспарціроўкі і захоўвання проб, стандартызаваная праца клінічных лабараторый, інтэрпрэтацыя вынікаў і кантроль якасці з'яўляюцца ключавымі фактарамі для забеспячэння дакладнасці і надзейнасці вынікаў аналізаў.Па выніках знешняй ацэнкі якасці, праведзенай Клініка-лабараторным цэнтрам Нацыянальнай камісіі па ахове здароўя 16-24 сакавіка 2020 года, з 844 лабараторый, якія атрымалі сапраўдныя вынікі, 701 (83,1%) адпавядала патрабаванням, 143 (16,9%) - не.Кваліфікаваны, агульныя ўмовы лабараторнага тэсціравання добрыя, але ў розных лабараторыях па-ранейшаму ёсць адрозненні ў здольнасці персаналу да працы, магчымасці інтэрпрэтацыі станоўчых узораў адной мэты і кантролю якасці.

Як паменшыць ілжывы адмоўны вынік выяўлення нуклеінавай кіслаты SARS-CoV-2?

Скарачэнне ілжывых адмоўных вынікаў пры выяўленні нуклеінавых кіслот павінна быць аптымізавана з чатырох аспектаў атрымання ілжывых адмоўных вынікаў.

(1) У клетках заражанага чалавека ёсць пэўная колькасць віруса.Канцэнтрацыя віруса ў розных частках цела людзей, якія падазраюцца на заражэнне, у розны час будзе рознай.Калі глоткі няма, гэта можа быць у бранхіяльнай вадкасці або кале.Калі некалькі тыпаў узораў могуць быць сабраны адначасова або на розных стадыях прагрэсавання захворвання для аналізу, гэта дапаможа пазбегнуць ілжывых адмоўных вынікаў.

(2) Клеткі, якія змяшчаюць вірус, павінны быць сабраны падчас збору проб.Гэтую праблему можна ў значнай ступені вырашыць шляхам узмацнення падрыхтоўкі зборшчыкаў узораў.

(3) Надзейныя рэагенты IVD.Праводзячы даследаванні па ацэнцы эфектыўнасці выяўлення рэагентаў на нацыянальным узроўні і абмяркоўваючы існуючыя праблемы, можна яшчэ больш павысіць эфектыўнасць выяўлення рэагентаў і адчувальнасць аналізу.

(4) Стандартызаваная праца клінічных лабараторый.Узмацняючы навучанне лабараторнага персаналу, пастаянна ўдасканальваючы сістэму кіравання якасцю лабараторый, забяспечваючы разумныя падзелы і паляпшаючы здольнасць персаналу выяўляць, можна паменшыць ілжывыя адмоўныя вынікі з-за няправільных лабараторных аперацый.

Прычыны паўторнага станоўчага тэсту на нуклеінавыя кіслаты SARS-CoV-2 у ачунялых і выпісаных пацыентаў

«План дыягностыкі і лячэння COVID-19 (пробнае сёмае выданне)» выразна вызначае, што адным з крытэрыяў вылячэння пацыентаў з COVID-19 і выпіскі з бальніцы з'яўляецца тое, што ў двух паслядоўных пробах з дыхальных шляхоў быў адмоўны тэст на нуклеінавую кіслату (з інтэрвалам не менш за 24 гадзіны), але іх вельмі мала. Тэст на нуклеінавую кіслату SARS-CoV-2 зноў быў станоўчым у выпісаных пацыентаў па розных прычынах.

(1) SARS-CoV-2 - новы вірус.Неабходна далейшае разуменне яго патагеннага механізму, поўнай карціны выкліканага захворвання і асаблівасцяў плыні захворвання.Такім чынам, з аднаго боку, неабходна ўзмацніць вядзенне выпісаных хворых і праводзіць 14-дзённае медыцынскае назіранне.Праводзіць наступнае назіранне, маніторынг здароўя і медыцынскае кіраўніцтва, каб паглыбіць разуменне ўсяго працэсу ўзнікнення, развіцця і зыходу захворвання.

(2) Пацыент можа зноў заразіцца вірусам.Акадэмік Чжун Наньшань сказаў: паколькі ў вылечаных пацыентаў ёсць антыцелы, ВРВІ-CoV-2 можа быць ліквідаваны антыцеламі, калі яны зноў уварваюцца.Ёсць шмат прычын, якія могуць быць прычынай выздараўлення пацыента, або гэта можа быць звязана з мутацыяй віруса, або нават прычынай лабараторнага аналізу.Калі гэта сам вірус, мутацыя SARS-CoV-2 можа прывесці да таго, што антыцелы, якія выпрацоўвае вылечаны пацыент, будуць неэфектыўнымі супраць мутаванага віруса.Калі пацыент зноў заражаны мутаваным вірусам, аналіз на нуклеінавыя кіслаты можа быць зноў станоўчым.

(3) Што тычыцца лабараторных метадаў тэсціравання, кожны метад тэсціравання мае свае абмежаванні.Выяўленне нуклеінавай кіслаты SARS-CoV-2 абумоўлена выбарам паслядоўнасці гена, складу рэагентаў, адчувальнасцю метаду і іншымі прычынамі, якія прыводзяць да таго, што існуючыя наборы маюць свае ніжнія межы выяўлення.Пасля лячэння пацыента колькасць віруса ў арганізме памяншаецца.Калі вірусная нагрузка ва ўзоры, які трэба праверыць, ніжэй ніжняй мяжы выяўлення, з'явіцца «адмоўны» вынік.Аднак гэты вынік не азначае, што вірус у арганізме цалкам знік.Вірус можа быць пасля спынення лячэння.Адраджэнне», працягвайце капіяваць.Такім чынам, рэкамендуецца праводзіць агляд раз у тыдзень на працягу 2-4 тыдняў пасля выпіскі.

(4) Нуклеінавая кіслата з'яўляецца генетычным матэрыялам віруса.Вірус гіне пасля таго, як пацыент прайшоў супрацьвіруснае лячэнне, але тыя, што засталіся фрагменты віруснай РНК яшчэ застаюцца ў арганізме чалавека і не выводзяцца цалкам з арганізма.Часам, пры пэўных абставінах, гэта можа быць больш захавана.Доўгі час, і ў гэты час тэст на нуклеінавых кіслот будзе «пераходным» станоўчым.Пры павелічэнні тэрміну аднаўлення пацыента пасля паступовага вычарпання рэшткавых фрагментаў РНК у арганізме вынік аналізу нуклеінавай кіслаты можа стаць адмоўным.

(5) Вынікі тэсту на нуклеінавую кіслату SARS-CoV-2 толькі даказваюць наяўнасць або адсутнасць віруснай РНК і не могуць даказаць актыўнасць віруса і тое, ці з'яўляецца вірус трансмісіўным.Неабходна даказаць, ці стане пацыент, у якога паўторна станоўчы тэст на нуклеінавыя кіслаты, зноў крыніцай інфекцыі.Неабходна правесці пасеў віруса на клінічных пробах і культываваць «жывы» вірус, каб даказаць, што ён заразны.

Рэзюмэ

Такім чынам, немагчыма цалкам пазбегнуць ілжывых адмоўных вынікаў тэсту на нуклеінавыя кіслаты SARS-CoV-2, станоўчых вынікаў паўторнага тэсту і іншых станаў, якія не адпавядаюць клінічным праявам.Пры фактычным скрынінгу і тэставанні рэкамендуецца аб'яднаць клінічныя сімптомы, візуалізацыйныя даследаванні (КТ) і эксперыменты, вынікі лабараторнага аналізу (аналіз на нуклеінавыя кіслаты + тэст на вірус-спецыфічныя антыцелы) для комплекснай дыягностыкі, каб прадухіліць прапушчаны дыягназ і памылковы дыягназ.Калі вынікі тэсту відавочна не адпавядаюць клінічным праявам, рэкамендуецца правесці комплексны аналіз усяго звяна тэсту (звязкі збору, цыркуляцыі і апрацоўкі проб), каб выключыць ранняе заражэнне вірусам SARS-CoV-2, рэцыдывавальнае заражэнне або спалучэнне з іншымі рэспіраторнымі віруснымі інфекцыямі і інш.Калі дазваляюць умовы, рэкамендуецца сабраць больш адчувальныя ўзоры, такія як мокрота або альвеалярны лаваж для паўторнага даследавання.

Спадарожныя тавары:

Набор для выяўлення нуклеінавых кіслот SARS-CoV-2 (метад мультыплекснай ПЦР з флуоресцентным зондам)

Час публікацыі: 3 верасня 2021 г